3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.2. Xác định số l−ợng vi khuẩn E.coli và Salmonella trong phân của dê bình th−ờng và dê tiêu chảy bằng ph− ơng pháp pha loãng đếm số trên
bình th−ờng và dê tiêu chảy bằng ph−ơng pháp pha loãng đếm số trên mặt thạch (Quinn và cs, 1994 [110])
Xác định số l−ợng vi khuẩn bằng ph−ơng pháp pha loãng và đếm số khuẩn lạc (C.F.U) trên thạch (Spread plate method ).
* Chuẩn bị dịch pha loãng
Dùng dãy ống nghiệm vô trùng gồm 6 ống và đ−ợc đánh số thứ tự 1,2,..6. Cho n−ớc sinh lí vào ống thứ nhất 9 ml, những ống còn lại mỗi ống 4,5ml. Cân 1 gam phân cho vào ống 1, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng trộn đều và dùng máy lắc để lắc cho tan phân. Dùng Pipet vô trùng hút 0,5 ml từ ống 1 chuyển sang ống 2 và dùng máy lắc để trộn đều, đ−ợc độ pha loãng 10-2, hút 0,5 ml từ ống 2 sang ống thứ 3 và trộn đều. Cứ tiếp tục làm t−ơng tự nh− vậy với các ống tiếp theo ta đ−ợc độ pha loãng từ ống 1 đến ống 6 lần l−ợt là: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
* Cấy và dàn mỏng dịch pha loãng.
Dùng pipet vô trùng hút 0,2 ml dịch pha loãng ở ống thứ 5 (10-5) hoặc ống thứ 6 (10-6), mở hé nắp đĩa thạch nhỏ vào giữa đĩa, dùng que gạt thuỷ tinh vô trùng dàn đều toàn bộ mặt thạch. Tiếp theo, đặt các đĩa thạch đã láng vi khuẩn ở dạng nắp trên đáy d−ới tại phòng cấy từ 3-5 phút để huyễn dịch thấm đều mặt thạch. Sau đó, lật ng−ợc và đặt các đĩa thạch đã láng trong tủ ấm 370C, nuôi cấy trong vòng 24 giờ.
* Đọc kết quả
- Xác định số l−ợng vi khuẩn trong 1 gam phân:
Đếm số khuẩn lạc ở mỗi đĩa, sau đó tính số l−ợng khuẩn lạc trung bình. Từ đó, tính số l−ợng vi khuẩn trong 1 gam phân theo công thức: X=5.a.b
Trong đó: a là số l−ợng khuẩn lạc trung bình của các đĩa cấy b là độ pha loãng mẫu.
- Xác định số loại vi khuẩn:
Căn cứ vào đặc điểm đặc tr−ng của từng loại khuẩn lạc (màu sắc, dạng khuẩn lạc, độ lớn, độ bóng) để xác định loại vi khuẩn E.coli và Salmonella
Xác định số l−ợng và định loại vi khuẩn E.coli và Salmonella đ−ợc tiến hành theo quy trình ở sơ đồ 3.1 và 3. 2.