D. BẢO TỒN PHÔI
2. Kỹ thuật cấy truyền phô iở một số loài vật nuôi
Hiện nay, có 2 phương pháp cấy truyền phôi được áp dụng: Phẫu thuật và không phẫu thuật. Mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng. Cấy truyền phôi bằng phương pháp phẫu thuật có tỷ lệ đậu thai cao hơn, nhưng phức tạp và đòi hỏi phải các cơ sở phải có trang bị hạ tầng và thiết bị hiện đại. Phương pháp cấy phôi không qua phẫu thuật tuy tỷ lệ đậu thai thấp hơn phương pháp phẫu thuật chút ít, nhưng hiện nay được sử dụng nhiều hơn trong sản xuất của Việt Nam. do phương pháp này đơn giản, tiện lợi, dễ áp dụng và không đòi hỏi các thiết bị hiện đại. Đồng thời, nếu kỹ thuật viên có tay nghề giỏi sẽ cho tỷ lệ đậu thai không thua kém phương pháp phẫu thuật.
Tỷ lệ đậu thai sau khi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng phôi, dung dịch nuôi cấy, sự đồng pha giữa con cái cho hoặc tuổi của phôi với con cái nhận. Tỷ lệ này rất biến động, từ 0-100%. Hiện nay, tỷ lệ đậu thai bằng phương pháp cấy truyền phôi ở các nước có nền chăn nuôi tiên tiến (Mỹ, Can da, New Zealand) là 65- 75% đối với
50-60% đối với phôi tươi và 40-50% đối với phôi đông lạnh. Ở Việt Nam, tỷ lệ đậu thai là 40-50% đối với phôi tươi và 35-40% đối với phôi đông lạnh
Trong thời gian từ lúc khai thác đến lúc cấy truyền phôi, phôi được nuôi dưỡng trong môi trường PBS (Phosphate Buffered Saline), ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm. Sức sống của phôi có thể hoàn toàn bình thường trong nhiều giờ. Để cấy truyền phôi, người ta phải tiến hành đóng liều phôi. Phương pháp đóng liều quen thuộc nhất là đóng liều bằng cọng rạ. Việc đóng liều cọng rạ được thực hiện theo cách sau: Phôi + PBS nằm ở giữa cọng rạ và ở cả 2 đầu của cọng rạ, mỗi đầu 1 bọt khí. Những phần rỗng còn lại của cọng rạ được lấp đầy bằng PBS, ở đầu tận cùng của cọng rạ được bịt kín bằng polyvinylpyrolidone (hình 6.8). Phôi được đưa trở lại tử cung của động vật nhận có chu kỳ động dục đồng pha một cách hoàn toàn với chu kỳ động dục của động vật cho, ở bên sừng tử cùng bên với thể vàng buồng trứng.
2.1. Cấy truyền phôi ở bò
Có 2 phương pháp để cấy truyền phôi ở bò là: Phương pháp phẫu thuật và phương pháp không phẫu thuật
2.1.1. Phương pháp phẫu thuật: Có thể cấy truyền phôi qua cơ đường trắng hoặc
qua cạnh sườn
+ Phương pháp cấy truyền phôi qua cơ đường trắng
Kỹ thuật mổ giống như đối với kỹ thuật được thực hiện để khai thác phôi, nhưng những thao này đơn giản hơn. Khi tử cung được bộc lộ ra ngoài, người ta xác định buồng trứng mang thể vàng. Dùng dụng cụ chọc ra một lỗ nhỏ ở 1/3 phía trên sừng tử cung cùng bên buồng trứng mang thể vàng, sau đó dùng 1 xi lanh có thể tích 1 -2ml chứa cọng rạ đựng phôi để đưa phôi và môi trường vào trong tử cung ở vị trí đã chọc. (Hoặc dùng xi lanh đưa phôi vào ống dẫn trứng nếu tuổi phôi ở giai đoạn còn non, từ 4-8 tế bào)
Kỹ thuật truyền phôi này cho kết quả dương tính từ 60-70%. Tuy nhiên nó cũng có những bất lợi là đòi hỏi một số trang thiết bị hiện đại và các kỹ thuật viên lành nghề.
+ Phương pháp cấy truyền phôi qua cạnh sườn
Động vật được gây mê cục bộ qua màng cứng. Người ta tiến hành xác định vị trí của buồng trứng mang thể vàng qua trực tràng. Việc xác định này cho biết các thao tác can thiệp phẫu thuật sẽ được tiến hành ở cạnh sườn bên phải hoặc bên trái. Đường rạch
được định vị ở phần trước của mạng sườn, ngay dưới góc háng.
Sau khi xác định được vị trí can thiệp, vùng phẫu thuật được cạo sạch lông, tiệt trùng và gây tê. Người ta rạch một đường dưới da dài khoảng 10- 12 cm, những lớp cơ được tách ra bằng những chiếc kẻo có đầu tù và màng bụng được chọc thủng ra bằng ngón tay hoặc đầu tù của kéo. Không phải lúc nào người ta cũng có thể nhìn thấy buồng trứng để kiểm tra một cách chính xác, nhưng người ta có thể sờ thấy buồng trứng qua trực tràng. Thao tác cần chú ý tránh tác động có thể làm hỏng thể vàng. Nếu như vết rạch lùi về phía sau thì thông thường có thể bộc lộ được đỉnh của sừng tử cung. Khi bộc lộ được sừng tử cung, việc cấy truyền phôi được thực hiện giống như phương pháp cấy truyền phôi qua cơ đường trắng. Bởi vì động vật nhận phôi rất hiếm khi bất động hoàn toàn, nên cách tốt nhất là dùng xi lanh đủ dài nối với cọng rạ để cấy truyền phôi. Một số nhà phẫu thuật đã không bộc lộ tử cung mà thực hiện các can thiệp ở trong xoang bụng.
Kỹ thuật cấy truyền phôi qua cũng sườn đơn giảm và ít điều kiện ràng buộc hơn là kỹ thuật cấy truyền phôi qua cơ đường trắng, nhưng có nhược điểm là phải để con vật ở trạng thái tương đối bất động. Trạng thái không yên tĩnh của con vật có thể làm cho các thao tác thiếu chính xác.
2.1.2 . Phương pháp không phẫu thuật (cấy truyền phôi qua cổ tứ cung)
Phương pháp cấy truyền phôi qua cổ tử cung được áp dụng đơn giản hơn nhiều so với các phương pháp phẫu thuật, nhưng đòi hỏi phải có một thiết bị thích hợp cho phép đặt phôi vào vị trí phù hợp và tránh được những tổn thương cục bộ cũng như là sự nhiễm trùng tử cung.
Cấy truyền phôi không phẫu thuật là đưa phôi vào đến phần trên của sừng tử cung chứ không cấy vào ống dẫn trứng (hình 6.l0). Như vậy, cấy truyền phôi chỉ thực hiện cho những con cái đã động dục được 6-8 ngày (thường là 7 ngày). Đây là phương pháp được áp dụng khá phổ biến ở Việt Nam trong những năm qua.
Rãnh ngoài tử cung; 2. Vách ngăn giữa hai sừng tử cung; 3. Vị trí phôi cần được cấy
Hình 6.10. Vị trí cấy phôi trong tử cung bằng phương pháp không phẫu thuật
Để thực hiện phương pháp này, người ta phải thực hiện quy trình cấy truyền
phôi được tóm tắt như sau:
a/ Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Dụng cụ: gồm kính hiển vị nổi (Sterio Microscope), Micropipet để hút phôi vào cọng rạ; súng cấy phôi; vỏ nhựa lắp vào súng cấy phôi; áo nhân bao ngoài vỏ nhựa và súng để tránh nhiễm bẩn khi thao tác; các loại tranh để kẹp; cọng rạ các cỡ (tết nhất là cỡ 0,25 ml của Đức và Pháp); kẻo, dao để cắt cọng rạ; xi lanh các loại: 1, 5, 20 ml và các kim tiêm; dụng cụ mở rộng tử cung (nếu cần thiết), găng tay ngon.
- Hóa chất: gồm bông,: cồn 70o, giấy vệ sinh, thuốc gây tê, xà phòng, có thể tiêm progesteron để hỗ trợ.
b/ Đưa phôi vào cọng rạ
Phôi sau khi được đánh giá phân loại, nếu đạt.tiêu chuẩn cấy và có bò nhận phôi, kỹ thuật viên phải hút phôi vào cọng rạ để cấy truyền. Cọng rạ phải sạch, vô trùng và thường phải cắt đi 1-2 cm để vừa với súng cấy phôi. Phôi được hút vào cọng rạ bằng micropipet hoặc bằng cách lắp trực tiếp cọng rạ phía nút co ton với xi lanh 1 ml.
Để tránh sự nhầm lẫn trong việc chọn. cặp bò cho - nhận khi cấy truyền, trên cọng rạ phải ghi các thông tin cần thiết. Khi phôi đã nằm trong cong rạ, cọng rạ luôn phải giữ ở tư thế nằm ngang, tránh tác động của ánh sáng và nhiễm khuẩn cho đến lúc lắp vào súng để cấy.
c/ Lắp cọng rạ vào súng cấy phôi
Mọi tháo tác lắp cọng rạ chứa phôi vào súng cấy phôi giống như lắp cọng rạ chứa tinh vào súng bắn tinh. Sau khi đã đưa cọng rạ vào súng, lắp vỏ nhựa ngoài súng và áo nilon ngoài vỏ nhựa. Các thao tác cấy truyền phôi cần tiến hành nhanh, chính xác, tránh tác động của môi trường nhiễm khuẩn.
d/ Chuẩn bị bò nhận phôi
Bò nhận phôi đã được phát hiện động dục trước. Trước khi cấy, bò nhận phôi phải được khám để xác định thể vàng và chất lượng thể vàng (có thể khám trước 1 ngày hoặc trước 1/2 ngày). Khi khám không tác động mạnh và nhiều lên buồng trứng để tránh ảnh hưởng xấu đến thể vàng. Ghi nhận vị trí của thể vàng ở bên phải hay bên trái để cấy truyền phôi vào sừng tử cung hoặc vòi trứng cùng bên với thể vàng. Tiêm thuốc gây tê vùng khum đuôi với liều lượng thích hợp tùy theo từng loại thuốc.
Dùng nước âm rửa sạch âm hộ, hậu môn và xung quanh. Dùng giấy vệ sinh lau khô âm hộ, cuối cùng dùng bông thấm cồn lau lại
Khi chọn cặp cho - nhận cần chú ý là cặp này phải tương đồng về trạng thái sinh lý sinh dục để nâng cao tỷ lệ đậu thai. Phôi thường được dội rửa vào ngày thứ 7 sau phối giống (tức là giai đoạn phôi dâu hoặc phôi nang) nên bò nhận phôi phải đã động dục được 6-8 ngày. Phôi dâu dùng cấy cho bò động dục trước đó 6 ngày, phôi nang sớm hoặc phôi dâu muộn cấy cho bò động dục trước đó 7 ngày, phôi nang giai đoạn cuối hoặc phôi nang trương nở dùng cấy cho bò động dục trước đó 8 ngày
e/ Thao tác cấy truyền phôi
Thao tác cấy truyền phôi bằng phương pháp không phẫu thuật cơ bản giống như thao tác dẫn tinh cọng rạ, chỉ khác ớ vị trí: dẫn tinh được thực hiện ở mặt trước cổ tử cung, tiếp giáp với thân tử cung hoặc gốc giữa thân và sừng tử cung, còn cấy truyền phôi thì phôi được bơm vào chóp sừng tử cung (l/3 phía trên sừng tử cung).
Để đảm bảo vô trùng, khi súng cấy phôi đi đến lỗ cổ tử cung, áo nhân mới được chọc thủng để súng đi qua lỗ thủng của túi đi vào trong cổ tử cung. Tiếp tục đưa súng đi qua cổ tử cung, vào sừng tử cung phía buồng trứng có thể vàng. Đầu súng cấy phôi phải đi sâu vào đỉnh chóp sừng tử cung. Khoảng cách từ gốc sừng tử cung (chỗ chế ba) tới đỉnh súng thường từ 5-10 cái. Khi đầu súng đã vào đúng vị trí, lúc đó kỹ thuật viên mới bơm phôi. Thao tác cấy truyền phôi phải.nhanh nhẹn, nhẹ nhàng, tránh làm xây
để làm giãn cổ tử cung trước khi đưa súng cấy phôi đi qua.
Thời gian cấy truyền phôi càng nhanh cành tốt (khoảng 1 -3 phút là tốt nhấn. Thời gian thao tác dài làm tỷ lệ đậu thai thấp do sự vận động co bóp quá nhiều của cơ quan sinh dục cái.
f/ Khám thai bò nhận phôi
Sau khi cấy truyền phôi được 2-3 tháng, bò nhận phôi cần được khám thai. Khi khám thai bò cần chú ý các điểm sau đây:
- Sau khi cấy truyền phôi 10- 12 ngày, cần theo dõi sự xuất hiện động dục của bò .
nhận bằng cách quan sát 2-3 lần/ngày các ngày theo dõi vì lúc này ứng với ngày thứ 10-22 của chu kỳ động dục. Nếu thấy bò động dục cần ghi chép, không cấy phôi ngay vì có thể động dục giả. Bò sẽ được cấy phôi nếu xuất hiện động dục ở chu kỳ sau.
- Có thể xác định khả năng chửa của bò qua việc xác định hàm lượng progesteron trong máu ở ngày thứ 21-23 của chu kỳ (sau 2 tuần kể từ khi cấy truyền phôi). Nếu hàm lượng progesteron trong máu cao hơn 2,5 mg/ml thì có thể kết luận bò nhận phôi đã có chứa. Độ chính xác của phương pháp này đạt tới 85% nếu bò có chửa và 98ơ/o nếu bò không có chửa. Việc định hàm lượng progesteron có thể được lặp lại sau 3 tuần.
- Phương pháp chẩn đoán có chửa chính xác nhất là: sau khi cấy truyền phôi 50- 60 ngày, khám qua trực tràng (đối với kỹ thuật viên giỏi); sau 90 ngày, khám thai cho kết quả chính xác 100% (đối với các kỹ thuật viên khác)
2.2. Cấy truyền phôi ở dê, cừu
Cấy truyền phôi ở những động vật này được thực hiện duy nhất qua đường phẫu thuật bằng cách gây mê toàn thể hoặc cục bộ. Gây mê cục bộ có lợi ích là rẻ tiền và nhanh chóng. Người ta tiến hành rạch ở cơ đường trắng một đoạn có độ dài giới hạn nhằm bộc lộ hoặc là vòi trứng hoặc là đầu tận cùng của sừng tử cung mà việc cấy truyền phôi được thực hiện ở vòi trứng hoặc sừng tử cung đó.
Bình thường ở cừu và dê, trứng thụ tinh đi vào trong tử cung ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 4 sau lúc bắt đầu động dục. Nếu trứng được thu hoạch trước ngày thứ 4 thì cấy truyền phôi được thực hiện ở vòi trứng bằng cách đưa pipet chứa phôi qua loa kèn đến độ sâu từ 3-5 cái và bơm phôi vào. Những phôi ở trên 4 ngày tuổi được truyền cấy trực tiếp vào trong tử cung bằng cách chọc qua thành tử cung.
2.3. Cấy truyền phôi ở ngựa
Cấy truyền phôi ở ngựa có thể thực hiện bằng 2 phương pháp: qua tử cung và phẫu thuật. Cấy truyền phôi thực hiện qua tử cung cần tới sự giúp đỡ của thiết bị cấy truyền phôi. Thiết bị này tương đương một súng bắn tinh nhân tạo, nhưng dài hơn. Thiết bị này được giữ trong tay đi găng và được đưa vào tử cung. Phôi được đặt vào thân tử cung hoặc ở sừng tử cung cùng bên với buồng trứng mang thể vàng. Trong
trường hợp đặt vào sừng tử cung, người ta phải dùng một tay khác đưa qua trực tràng để hướng dẫn thiết bị đi vào sừng tử cung. Người ta nhận thấy rằng, kỹ thuật đặt phôi vào thân tử cung là thông dụng hơn, bởi vì nó có lợi thế là tránh được những thao tác có thể làm rối loạn cân bằng hormon. Thật vậy, bằng các nghiên cứu điện cơ đồ, người ta biết rằng cơ tử cung của ngựa co thắt và mẫn cảm nhiều hơn với những kích thích bên ngoài so với cơ tử cung của bò và dê, cừu. Như vậy, chỉ cần lấy dịch màng trong tử cung hoặc đơn giản là sự co giãn cổ tử cung ở ngày thứ 6-7 sau khi rụng trứng là có thể đủ để gây ra phá hủy thể vàng và từ đó dẫn đến động dục, do đó kỹ thuật cấy truyền phôi qua tử cung cho ngựa phải đi kèm theo sự thao tác tối thiểu và nhẹ nhàng.
Phương pháp cấy truyền phôi qua phẫu thuật ở ngựa rất giống như phương pháp cấy truyền phôi bằng con đường phẫu thuật mô tả ở bò. Phương pháp này bao gồm những công đoạn sau: Mở bụng ở cơ đường trắng, bộc lộ sừng tử cung cùng bên với buồng trứng mang thể vàng, chọc thủng cơ tử cung và màng trong tử cung bằng một kim đầu tròn để tránh chảy máu, lồng qua lỗ chọc đầu pipet đã tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur hoặc là cọng rạ chứa phôi. Người ta đẩy pipet hoặc cọng rạ chứa phôi vào sâu 2-3 cm trong lòng tử cung về phần đỉnh của sừng tử cung và đẩy phôi vào.
Tốt nhất đối với việc cấy truyền phôi trong tử cung là sử dụng những phôi từ 6-8 ngày tuổi, được thu hoạch trước khi cấy truyền 2-3 giờ và được bảo tồn trong những bình thể tích nhỏ với môi trường PBS tươi, ở nhiệt độ 30oc cho đến tận thời điểm cấy truyền.
Phụ lục
QUY TRÌNH KỸ THUẬT TRUYỀN GIỐNG NHÂN TẠO BÒ
(Cục Khuyến nông - Bộ Nông nghiệp và PTNT, 1995)
A. Quy trình kỹ thuật truyền giống nhân tạo bò bằng tinh đông viên
1. Những quy định chung
1.1 Dụng cụ chuyên dùng
1. Phải có bình chuyên dùng chứa nhơ lỏng và tinh viên, tinh phải để ngập trong não lỏng ở trong bình.
2. Phải có dẫn tinh quản bằng nhựa cứng trong suốt, dài 45 cm và Φ = 3mm. 3. Phải có núm cao su chuyên dùng cho thụ tinh nhân tạo.
4. Phải có tranh kẹp bằng thép không rỉ dài 20cm. 5. Phải có các ống nước sinh lý để pha chế tinh viên. 6. Phải có găng tay ni lông dài 30-60 cm.
1.2. Vệ sinh vô trùng
1. Dẫn tinh quản phải được vệ sinh và tiệt trùng trước khi dùng để phối giống cho bò.
2. Nước sinh lý phải được tiệt trùng và đóng vào các ampul vô trùng loại 1ml. 3. Panh kẹp phải vệ sinh vô trùng sau mỗi lần sử dụng.