5.1. Mục đích
Tinh trùng sau khi ra khỏi cơ thể chỉ sống được trong một thời gian rất ngắn (tính bằng giờ, thậm chí bằng phút). Vì vậy, trong công tác thụ .tinh nhân tạo người ta phải tiến hành bảo tồn tinh dịch nhằm mục đích: kẻo đài thời gian sống của tinh trùng ở bên ngoài cơ thể, trên cơ sở đó nâng cao khả năng sản xuất của con đực và mở rộng bán kính gieo tinh.
Thực chất của bảo tồn tinh dịch chính là quá trình bảo tồn đen. Muốn bảo tồn được đen trong một thời gian dài, cần phải kìm hãm quá trình trao đổi chất của tinh trùng thông qua việc ức chế hoạt động của các enzym đặc biệt các enzym phân giải đường, vì bản chất của sự trao đổi chất ở tinh trùng là các quá trình đường phân. Dựa trên nguyên tắc này, người ta đã đưa ra một số phương pháp bảo tồn tinh dịch khác nhau, phù hợp với từng loài gia súc và từng điều kiện cụ thể.
5.2. Các phương pháp bảo tồn tinh dịch
5.2.1. Bảo tồn ở dạng lỏng bằng nhiệt độ thấp
Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiệt độ thấp nhưng chưa tới mức làm cho tinh dịch đông lạnh để hạn chế hoạt động của tinh trùng.
Đối với tinh dịch lợn , nhiệt độ bảo tồn thích hợp từ 10- 150C. Ở nhiệt độ dưới 1 góc và trên 20oC kết quả bảo tồn kém . Trong trường hợp pha loãng tinh dịch để sử dụng ngay thì có thể bảo tồn ở nhiệt độ bình thường từ 20-25oC (có thể không cần bổ sung lòng đỏ trứng).
Đối với tinh dịch trâu bò, nhiệt độ bảo tồn thấp hơn so với tinh dịch lợn. Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 0 - 5oC và thông thường người ta bảo tồn trong phích lạnh.
5.2.2. Bảo tồn ở dạng lông bằng hóa chất (ở nhiệt độ phòng từ 20 - 22oC)
Phương pháp này được áp dụng trong phòng có máy điều hòa nhiệt độ duy trì nhiệt độ ổn định từ 20-220C. Chỉ cần đặt lọ tinh vào nơi không có ánh nắng và tia cực tím. Hàng ngày đảo nhẹ lọ tinh từ 1-2 lần.
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng hoá chất để ức chế hoạt động trao đổi chất của tinh trùng. Một trong các phương pháp đó là: sử dụng khí CO2 bê ức chế hoạt động của tinh trùng. Phương pháp dựa trên việc cho khí CO2 lội vào trong môi trường pha loãng tinh dịch đến khi bão hoà, sau đó tiến hành pha loãng và bảo tồn tinh dịch. Phương pháp này có thể cho phép bảo tồn tinh dịch ở nhiệt độ bình thường từ 20-22oC.
* Cách tiên hành: Sử dụng hệ thống bình sinh khí CO2 thường là hệ thống bình Kiip (như hình vẽ). Đáy của bình Kiip chứa ax~it clohydric 20%, phần bầu ở giữa bình chứa phấn trắng hoặc đá vôi (CaCO3). Trong bình sẽ xảy ra phản ứng hoá học:
Sơ đồ hệ thống bình Kiip
Khí CO2 sinh ra được dẫn qua bình thứ nhất chứa dung dịch NaOH 15% (để trung hoà axit bay theo khí CO2) sau đó, khí CO2 tiếp tục được dân qua bình thứ hai chứa dung địch KMnO4 3% với mục đích làm sạch khí CO2. Cho khí CO2 sục vào bình chứa môi trường cho đến khi bão hoà trước khi pha loãng tinh dịch (chú ý không nên cho kháng sinh, lòng đỏ trứng trước khi làm bão hoà môi trường bằng. khi CO2). Thời gian cần thiết để làm bão hoà khí CO2 Phụ thuộc lượng môi trường nhiều hay ít. Thông thường, cứ 500ml môi trường người ta cho khí CO2 sục vào trong khoảng thời gian từ 5 - 8 phút là đạt yêu cầu.
Quá trình bão hoà bằng khí CO2 thường làm cho pH môi trường giảm đi, khi pH môi trường giảm xuống còn 6,4-6,5 thì dừng quá trình bão hoà lại, sau đó cho kháng sinh, lòng đỏ trứng vào và tiến hành pha loãng ngay với tinh dịch.
đóng vào các lọ có nút kín hoặc trong các chai thuỷ tinh gắn kín miệng để khí CO2
không thoát được ra ngoài.
5.2.3. Bảo tồn dạng đông lạnh
Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiệt độ rất thấp đến mức làm cho tinh dịch bị đóng băng để bảo tồn. Ở nhiệt độ rất thấp, quá trình trao đổi chất của tinh trùng bị ức chế gần như hoàn toàn, tinh trùng sống ở trạng thái tiềm sinh.
* Kỹ thuật pha loãng và bảo tồn tinh dịch ở dạng đông lạnh
- Sơ lược lịch sử bảo tồn tinh dịch ở dạng đông lạnh
Làm đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ thấp đã đánh dấu một tiến bộ đáng kể trong bảo tồn tinh dịch. Do những lợi ích của nó mang lại, ngày nay phương pháp làm đông lạnh tinh dịch đã được chấp nhận ở nhiều trung tâm thụ tinh nhân tạo.
Bảo tồn tinh dịch ở trạng thái lỏng và ở nhiệt độ bình thường cho phép thoả mãn những nhu cầu hàng ngày của các trung tâm thụ tinh nhân tạo, nhưng một phần lớn tinh dịch có nguy cơ không được sử dụng, gây ra tình trạng lãng phí, nhất là tinh dịch của những con đực giống tốt. Trái lại, tinh dịch được làm đông lạnh cho phép dự trữ trong một thời gian dài, ngay cả sau khi con đực đã chết. Phương pháp này còn cho thấy những lợi ích khác, như: chọn ghép đôi giao phối dễ đàng hơn, duy trì được giống, dòng, họ có giá trị giống cao, dễ dàng trao đổi tinh dịch giữa các trung tâm, ngay cả khi những trung tâm này ở cách xa nhau, dễ dàng lập thành những ngân hàng tinh ...
Ý tưởng dự trữ tinh dịch ở dạng đông lạnh đã có từ thế kỷ XVIII, nhưng lúc đó người ta lo ngại đến những ảnh hưởng xấu của nhiệt độ thấp có thể gây ra cho tinh trùng. Năm 1866 , Mantagozza đã chứng minh, tinh trùng của người có thể sống ở 170C và ngay từ thời điểm này, phương pháp làm đông lạnh tinh dịch đã thể hiện nhiều ích lợi trong chăn nuôi. Túy nhiên, phải chờ đợi gần một thế kỷ sau đó, phương pháp này mới trở thành hiện thực .
Luyet và Gehenio quan sát thấy, nhiều tế bào sống và các vi sinh vật được làm lạnh trong những điều kiện xác định cho thấy sự trao đổi của chúng bị giảm đến mức mà trên thực tế sự bảo tồn chúng có thể là vĩnh viễn và chúng có thể hồi sinh sau khi hâm nóng trở lại.
Schaffner, Henđerson và Cart đã thành công trong việc sử dụng dung dịch Levulose để bảo tồn tinh dịch của gia cầm. Bằng cách nhắc lại nghiên cứu này, năm 1949, Parkes, Smith và Polge đã phát hiện ra các đặc tính của glyxerin: Các tác giả này đã sử dụng đung địch albumine Meyer có chứa l0% glyxerin thay cho dung dịch Levulose và đã nhận thấy rằng, tinh trùng có thể sống trong dung dịch albumine ở nhiệt độ -79oC. Polge và con còn nhận thấy tith dịch của gia cầm đượcpha loãng trong dung dịch Ringer có thể chống chống lại những ảnh hưởng bất lợi của nhiệt độ thấp. Tinh dịch gà được làm đông lạnh ớ -79oC trong hỗn hợp nước đá CO2 vẫn sống và sau khi hâm nóng lên, tinh trùng vẫn hoạt động.tốt. những con gà được thụ tinh nhân tạo
với tinh dịch làm đông lạnh đã cho ra những trứng được thụ tinh và sản sinh ra những con gà con bình thường. Những thừ nghiệm này. đã được thực hiện trên tinh dịch của bò và những con bò con đã. được sinh ra từ . tịnh địch. được bảo tồn ở -79oC (Stewrt, 1951)
* Kỹ thuật pha loãng và bảo tồn tinh dịch ở nhiệt độ thấp của Pháp và châu Âu :
- Vai trò của glyxenn trong bảo tồn tinh dịch nhiệt độ thấp
Glyxerin cho phép tránh được những tổn hại đối với tinh trùng trong quá trình làm đông lạnh bằng cách nó thay thế nước bên trong tế bào, ngăn cản sự tạo thành những tinh thể trong tế bào tinh trùng, giữ cho tinh trùng sống trong suốt quá trình bảo tồn ở nhiệt độ thấp. Khi người ta đặt tế bào trong hỗn hợp chứa glyxerin thì tế bào đó ở trong môi trường ưu trương, một phần nước bị thoát ra ngoài do sự đồi chỗ của glyxerin đến tận khi sự cân bằng về nồng độ và áp suất được thiết lập.
Nhiều sản phẩm thay thế glyxerin đã được thử nghiệm nhưng không thu được kết quả, đó là những chất: propylene-glycol, trimethyl-glycol, mannitol, sorbitol và những protein của tinh thanh .
Lúc đầu, việc làm đông lạnh tinh dịch được thực hiện ở nhiệt độ -79oC nhờ vào hỗn hợp tuyết cacbônic-cồn. Hiện nay, nitơ lỏng, trên thực tế, là nguồn duy nhất để đạt tới nhiệt độ thấp và việc làm đông lạnh được thực hiện ở -196oC.
- Chọn tinh dịch để làm đông lạnh
- Những tiêu chuẩn quy định đối với tinh dịch đem bảo tồn ở trạng' thái tươi cũng được áp dụng cho tinh dịch được làm đông lạnh. Tinh dịch trước khi đem bảo tồn ở dạng đông lạnh phải được kiểm tra toàn bộ các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất. Chỉ những tinh dịch nào đạt các yêu cầu kỹ thuật quy định đối với từng loài, giống mới được làm đông lạnh. Ngoài ra, sau khi đã bảo tồn ở dạng đông lạnh, người ta còn kiểm tra sức kháng nhiệt của tinh trùng trước khi sử dụng cho việc dẫn tinh. Sức kháng nhiệt của tinh trùng được xác định bằng tỷ lệ % giữa số tinh trùng chuyển động tiến thẳng của một mẫu tinh dịch sau khi làm đông lạnh và hâm nóng trở lại so với số tinh trùng chuyển động tiến thẳng trước khi làm đông lạnh. Kỹ thuật xác định sức kháng nhiệt có thể được thực hiện theo 2 cách: Chậm và nhanh.
+ Cách 1 (chậm): được thực hiện bằng cách lấy ra một mẫu tinh dịch đã được làm đông lạnh. Ngâm mẫu này trực tiếp vào một bình cách thủy ở 38oc trong 5 giờ và sau đó xác định % tinh trùng tiến thẳng.
+ Cách 2 (nhanh): người ta lấy ra một mẫu tinh dịch đã để trong dung dịch nào
lỏng trong thời gian khoảng 20 giờ, ngâm mẫu này vào trong bình cách thủy ở 46oC trong 1/2 giờ, sau đó thực hiện việc đánh giá mức độ hoạt động của tinh trùng. Người ta thấy có một tương quan dương và có ý nghĩa cao giun khả năng thụ thai và sức vận động của tinh trùng sau khi hâm nóng trở lại, trong điều kiện tránh được những sai sót
- Kỹ thuật pha loãng và bảo tồn tinh dịch trâu, bò
Những môi trường pha loãng thường được sử dụng nhất là Tris-lòng đỏ trứng gà - glyxerin, môi trường sữa tách kem, laiciphos 470 và 480 của Jacque và Cassou. Một số tác giả đã khuyên cho thêm đường vào môi trường pha loãng nhằm làm dễ dàng sự đông lạnh. Các đường glucose, arabinose và thamnose, ở nồng độ 1,25% trong môi trường có xitrat và glyxerin có tác dụng bảo vệ tinh trùng trong thời gian cân bằng và đông lạnh. Đường fructose có cùng một tác dụng như trong môi trường sữa tách kem. Sự cho thêm các đường (hydrate carbone) vào môi trường pha loãng hình như có ảnh hưởng có lợi cho sự hồi .phục của tinh trùng sau sự làm đông lạnh. ảnh hưởng có lợi này có thể do sự thay đổi áp lực thẩm thấu của môi trường pha loãng kéo theo sự loại nước tốt hơn của tế bào tinh trùng.
Hiện nay, ở hầu hết các nước phương tây, môi trường pha loãng Laiciphos được sử dụng nhiều nhất đối với tinh dịch trâu bò. Kỹ thuật pha loãng tinh dịch trâu bò từ môi trường Laiciphos được làm như sau:
Môi trường pha loãng được chuẩn bị trước khi khai thác tinh dịch 1 giờ. Các bước pha chế môi trường được tiến hành theo các bước sau:
a/ Hòa tan 50 g Laiciphos 478 vào 400 ml H2O Cất ở 40oC trong 1 bình nón cụt và được lắc đều bằng một máy lắc từ tính.
b) Chuẩn bị một dung dịch chứa 100 ml H2O Cất ở 50oC và 50 ml lòng đỏ trứng gà Dung dịch này được đựng trong một bình nón khác và được khuấy đều nhờ một máy khuấy.
c/ Trộn 2 dung dịch này với nhau bằng cách rót dung dịch có lòng đỏ trứng gà vào trong dung dịch có Laiciphos.
d) Dung dịch thu được sau khi trộn 2 dung dịch trên được chia ra thành 2 phần bằng nhau. Một phần được giữ ở 32oC và một phần khác giữ ở 4oC.
Ngay sau khi khai thác, tinh dịch được đặt trong bình cách thủy ở 32oC và tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu về chất lượng và nồng độ tinh trùng. Công việc này cho phép biết được số lượng môi trường pha loãng cần sử dụng. Môi trường pha loãng cần thiết này được chia thành 2 phần bằng nhau: phần A được lấy ra từ dung dịch được giữ ở 32oC và phần B được lấy ra từ dung dịch được duy trì ở 4oC. Phần B này được cho thêm 14% glyxerin. Sau khi đã có môi trường, kỹ thuật pha loãng tinh dịch vào thôi trường bảo tồn Laiciphos và làm đông lạnh được tiến hành như sau:
+ Pha loãng ban đầu
Pha dung dịch A vào trong liều tinh. Quá trình pha này được thực hiện theo 2 giai đoạn: đầu tiên, cho dung dịch A vào tinh dịch với một thể tích bằng thể tích tinh dịch, để 2-3 phút cho tinh dịch đã được trộn đều với dung dịch A, rồi rót phần còn lại của dung dịch A vào tinh dịch.
+ Làm lạnh tinh dịch đã được pha loãng
Đặt bình chứa tinh dịch đã được pha loãng ban đầu vào trong một bình chứa 3/4 lít nước ở 30oC. Mức nước ở trong bình phải luôn luôn cao hơn độ cao của tinh dịch chứa trong bình. Bình này được đặt trong một tủ lạnh ở 4nc. Người ta để nhiệt độ tinh dịch giảm dần đạt tới 4oC trong vòng 45 đến 60 phút. Để cho nhiệt độ tinh dịch pha loãng giảm đến 40C trong thời gian 45-60 phút thì khi nhiệt độ tinh dịch xuống tới 20oC, cứ 5 phút, cho thêm khi một cục nước đá vào tủ lạnh.
Rót dung dịch chứa glyxerin (dung dịch Bị vào trong tinh dịch đã pha. Việc pha dung dịch B vào tinh dịch đã pha được thực hiện theo 4 giai đoạn, cách nhau 15 phút. Như vậy, nồng độ glyxerin lúc kết thúc pha chế sẽ là 7%. Tuy nhiên, hiện nay Cassou khuyên cho thêm 3% glyxerin vào dung dịch A và 11% vào dung dịch B. Cách làm này không làm thay đổi nồng độ glyxerin cuối cùng của tinh dịch pha, nhưng có ảnh tốt tới sự bảo vệ tinh trùng trong giai đoạn làm lạnh từ 320C - 40C. Sau khi pha xong, tinh dịch được duy trì ở 40C và chuẩn bị cho phân liều và đóng gói.
+ Phân liều và đóng gói
Tinh dịch được phân thành những liều hoặc là bằng ống thủy tinh, hoặc bằng ống nhựa, hoặc bằng cọng rạ chlorue polyvinyle (phương pháp của Pháp), hoặc là dạng viên.
Việc đóng gói cọng rạ theo phương pháp của Cassou đã được sử dụng rộng rãi và là phương pháp duy nhất được sử dụng ở Bỉ. Sử dụng phương pháp đóng liều cọng rạ rất đơn giản, kinh tế và cho phép dự trữ tối đa các liều trong một diện tích tối thiếu. Những cọng rạ hiện nay đang được sử dụng có 2 kiểu:
+ Cọng rạ trung bình có đường kính 2,8 tâm và có thể tích hữu hiệu 0,54 ml. + Cọng rạ nhỏ có đường kính 2 râm và thể tích 0,23 ml.
Ở cọng rạ nhỏ, sự dẫn truyền nhiệt tốt hơn do thể tích nhỏ của nó.
Về cấu tạo: cọng rạ có hình giống như một xi lanh, một đầu tận cùng được bịt kín bởi 2 núi bông bao quanh lớp bột polyvinyle làm' cho hệ thống này như là piston trong thụ tinh nhân tạo; đầu kia để mở và sẽ sử dụng để nạp tinh dịch vào (hình 4.2) Để nạp tinh dịch, những cọng rạ được sắp xếp thành từng bó nằm ngang có từ 15-20 cọng được định vị bởi một cái kẹp và lắp khớp với một lược hút. Lược hút này được nối với một bơm chân không cho phép hút tinh dịch vào cọng rạ. Khi cọng rạ được nạp đầy thì được lắc nhẹ nhàng và đóng nút sao cho sau khi đóng nút trong cọng rạ có một