D. BẢO TỒN PHÔI
3. Kỹ thuật cơ bản làm đông lạnh phôi
3.1. Chọn phôi
Không phải phôi nào cũng thích ứng và sống được trong quá trình làm đông lạnh và bảo tồn ở nhiệt độ rất thấp (-196oC) cho tới tận sau khi giải đông. Có khoảng 15- 20% phôi đưa vào làm đông lạnh bị phá hủy, chết hoặc thoái hóa. Vì vậy, trước khi đưa vào bảo tồn ở dạng đông lạnh, người ta phải lựa chọn phôi thật kỹ theo các tiêu chuẩn sau:
* Giai đoạn phát triển của phôi
Giai đoạn phát triển của phôi liên quan đến số lượng phôi bào đã phân chia (tức là có liên quan đến kích thước của từng phôi bào, tính thẩm thấu của màng tế bào, sức chịu nhiệt của chúng...). Phôi bò 6-8 ngày tuổi thường là phôi dâu và phôi nang các loại Phôi đâu, phôi nang sớm và phôi nang đem đông lạnh cho hiệu quả bảo tồn cao hơn. Phôi nang trương nở hoặc phôi nang thoát màng do đĩa phôi và xoang lớn, sức kháng cơ học do nhiệt độ thay đổi yếu hơn, làm hạn chế kết quả làm đông lạnh. Vì vậy, trong thực tế, phôi dâu và phôi nang (trừ loại trương nở và thoát màng) đem làm đông lạnh là phù hợp.
* Chất lượng phôi
Quá trình làm đông lạnh từ nhiệt độ phòng thí nghiệm đến nhiệt độ - 196oC đã làm thay đổi một số kết cấu của phôi, từ đó làm giảm sức sống và chất lượng phôi. Vì vậy, người ta chỉ chọn phôi có chất lượng tốt để làm đông lạnh (loại I, II hoặc loại A, B). Như vậy, khoảng 20-30% phôi loại III (C) bị loại bỏ hoặc phải cấy truyền phôi tươi
3.2. Bổ sung chất chống lạnh
Trong quá trình làm đông lạnh, các tinh thể nước đá sẽ kết tụ lại cả bên trong và bên ngoài phôi làm hư hại màng và mầm phôi. Để tránh tác hại này, cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy phôi các chất bảo vệ thích hợp, thường là glyxerin, Ethylene glycol, Dimethyl sulfoxide (D.M.S.O)
* Sử dụng glyxerin chống lạnh cho phôi
Glyxerin là chất bảo vệ tốt cho phôi trong quá trình làm đông lạnh. Nhược điểm của việc sử dụng glyxerin là quá trình giải đông phải tiến hành qua 3 bước, thời gian kéo dài, đồng thời phải có thêm dụng cụ như kính hiển vi, địa petri, dụng cụ hút phôi.
Phôi sau khi được đánh giá phân loại được đưa vào dung dịch PBS có chứa 15- 20% huyết thanh bê (FCS). Phôi đủ tiêu chuẩn làm đông lạnh được đưa vào môi trường có glyxenn bằng 1 trong 4 cách sau:
- Đưa phôi vào môi trường nuôi cấy có nồng độ glyxerin là 1 hoặc 1,5M. Để phôi trong môi trường này với thời gian 10- 15 phút .
Đưa phôi lần lượt vào trong 3 môi trường có nồng độ glyxerin tăng dần theo thứ tự sau: 0,3M glyxerin trong 2-5 phút; 0,75M glyxerin trong 4-10 phút và 1 hoặc 1,5M glyxerin trong 6- 10 phút.
Đưa phôi lần lượt vào trong 3 môi trường có nồng độ glyxerin như sau: 0,45; 0,9 và 1,4 M. Mỗi môi trường để trong thời gian 10 phút.
Đưa phôi vào môi trường PBS có 10% glyxerin. Môi trường này có chứa thêm một lượng đường nhỏ để giúp cho sự thẩm thấu của glyxerin qua màng phôi. Để phôi trong môi trường này 20 phút.
*Sử dụng Ethylene glycol
Có thể sử dụng Ethylene glycol thay cho glyxerin. Phương pháp này làm tương tự như đối với glyxerin, nhưng thời gian để phôi trong môi trường này ngắn hơn (5-lo phút). áp dụng phương pháp này, phôi được giải đông như tinh cọng rạ và sau khi giải đông có thể đưa phôi đi cấy truyền ngay.
Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, đơn giản, không cần kính hiển vi và một số dụng cụ khác, nhưng nhược điểm là không biết được chất lượng phôi trước khi cấy, tỷ lệ đậu thai sau khi cấy thường thấp hơn so với môi trường đông lạnh có glyxerin
3.3. Làm đông lạnh phôi
Sau khi đã để phôi vào các môi trường làm đông lạnh với khoảng thời gian cần thiết, phôi được hút vào cọng rạ đã ghi các thông tin cán thiết về phôi. Một cọng rạ có thể chứa 1, 2, 3 phôi, tùy theo yêu cầu và điều kiện cụ thể. Quá trình làm đông lạnh được thực hiện theo các chương trình định sẵn trên hệ thống máy làm đông lạnh. Quá trình này thường trải qua các giai đoạn sau:
- Đưa phôi từ nhiệt độ phòng thí nghiệm xuống -50C, -6oC hoặc -70C, tùy theo môi trường đông lạnh sử dụng. Khi đạt được nhiệt độ trên, giữ phôi ở nhiệt độ đó trong vòng 5-7 phút. Tốc độ hạ nhiệt độ trong giai đoạn này là loC/phút.
- Hạ nhiệt độ từ -50C (-6oC hoặc -7oC) xuống nhiệt độ -33oC hoặc -35oC với tốc độ 0,2-0,40C/phút. Giữ phôi ở nhiệt độ này từ 5-10 phút, sau đó lấy cọng rạ chứa phôi đưa thẳng vào nhơ lỏng (-196oC) và bảo quản với thời gian tùy thuộc vào mục đích người sử dụng