Kỹ thuật gây siêu bài noãn ở động vật cái được thực hiện qua 2 giai đoạn: chuẩn bị gia súc cho phôi và kích thích gây siêu bài noãn đối với gia súc cho phôi
3.1. Chuẩn bị gia súc cho phôi
Gia súc cho phôi thường được chọn trong đàn cái hạt nhân. Để đảm bảo thu được nhiều phôi và phôi tốt người ta phải đặt ra tiêu chuẩn để lựa chọn gia súc cho phôi. Gia súc cho phôi phải đạt được các tiêu chuẩn sau:
- Là những cá thể có năng suất cao về một hoặc vài tính trạng mong muốn và các tính trạng đó có khả năng di truyền cho đời sau. Nếu cùng một lúc mong muốn nhiều tính trạng, phải ưu tiên những tính trạng nào có hệ số di truyền cao, giá trị kinh tế lớn
- Khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, không hung dữ, cơ thể không có khuyết tật, dị tật. - Khả năng sinh sản tết, quá trình sinh đẻ bình thường, thể hiện ở:
+ Chu kỳ động dục bình thường, biểu hiện động dục rõ ràng
+ Bộ phận sinh dục không bị viêm, có hoạt động sinh dục bình thường ở các chu
kỳ, cổ tử cung thông suốt khi đưa dụng cụ rửa phôi vào
- Tuổi gia súc không quá già, không mắc bệnh truyền nhiễm
3.2. Kích thích gây siêu bài noãn
Kỹ thuật gây siêu bài noãn chủ yếu dựa vào sự tác động của các hom lon sinh. dục lên buồng trứng để kích thích sự phát triển, chín và rụng của tế bào trứng. Hai loại hormon chính được sử dụng để gây siêu bài noãn là Huyết thanh ngựa chửa và FSH.
* Huyết thanh ngựa chửa - PMSG (Pregnant Mares Serum Gonadotropin)
Huyết thanh ngựa chửa (PMSG) là hoạt chất sinh học được chiết xuất từ huyết thanh ngựa có chửa trong thời gian ngựa có chửa từ 45 - 120 ngày. Đây là một chất có hoạt tính vừa giống FSH vừa giống LH của tuyến yên. Nhờ tính chất hai mặt của nó mà PMSG được sử dụng để kích thích gây siêu bài noãn. PMSG có thể tiêm dưới da hoặc trong cơ. Tuy hoạt tính của PMSG kém hơn FSH nhưng nó được sử dụng nhiều để gây siêu bài noãn vì PMSG rất sẵn, chi phí sản xuất tương đối thấp so với FSH. Mặt khác thời gian bán hủy (half live invivo) của nó trong cơ thể tương đối đài (khoảng 6 ngày), nên khi sử dụng PMSG gây siêu bài noãn người ta chỉ cần tiêm một lần.
+ Cách sử dụng: PMSG có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với một số hon non
khác như: PMSG với HCG (Hu man Choronique Gonandotropin - Kích tố nhau thai người), hoặc PMSG với Prostaglandin nhóm F2α (pGF2α) và Progesteron
Nguyên lý của phương pháp này là hormon HCG, Progesteron khi đưa vào cơ thể gia súc sẽ có tác dụng khống chế ảnh hưởng của nang trội đối với các nang phát triển, từ đó làm cho nang trội bị thoái hoá. Khi đưa PMSG và cơ thể sẽ kích thích các nang phát triển, chín và rụng đồng loạt.
+ Liều lượng và thời gian sử dụng:
Tùy từng đối tượng gia súc khác nhau mà .liều lượng hormon và thời điểm đưa vào cơ thể cũng khác nhau, nhưng thời gian sử dụng để gây siêu bài noãn nằm trong pha thể vàng.
* FSH
FSH thường được chiết xuất từ tuyến yên của cừu hoặc lợn, vai trò chính của FSH là kích thích sự phát triển của noãn bao. Hoạt tính của FSH mạnh hơn so với PMSG cho nên sử dụng FSH gây kích thích rụng trứng cho kết quả cao hơn một chút so với việc sử dụng PMSG.
Vì thời gian bán hủy trong cơ thể của FSH ngắn, chỉ khoảng từ 2-5 giờ, cho nên trong quá trình sử dụng người ta phải tiêm cho gia súc liên tục trong nhiều ngày (tối đa 5 ngày) và mỗi ngày hai lần vào buổi sáng và buổi chiều (cách nhau 12 giờ).
3.3. Kỹ thuật gây siêu bài noãn ở một số loài động vật
3.3.1. Ở bò
Vào năm 1940- 1945, Casida và các đồng sự của ông ta đã mô tả kỹ thuật gây siêu bài noãn ở bò dựa trên nguyên tắc kích thích buồng trứng của con cái bằng cách cho uống gonadotropin tuyến yên hoặc gonadotropin nhau thai vào thời kỳ trước rụng trứng tự nhiên hoặc rụng trứng do kích thích. Tác động gây siêu bài noãn là kết quả tổng hợp của hai mặt: xúc tiến sự phát triển của một số noãn bao và ức chế sự thui chột của một số noãn bao khác. Những chất được sử dụng để gây siêu bài noãn là những chất có hoạt tính FSH bao gồm: PMSG và những chất chiết của tuyến yên động vật có vú (cừu, lợn, ngựa).
Phần lớn các nghiên cứu chứng minh rằng tỷ lệ siêu bài noãn biến động theo liều PMSG, nhưng nó cũng còn phụ thuộc vào các nhân tố khác như: tuổi, giống, mùa vụ, tình trạng dinh dưỡng và sự nhắc lại của các xử lý.
Những chất chiết của tuyến yên hoặc FSH cũng có hiệu quả như là PMSG. Trái với PMSG, chúng có một vài nhược điểm là: thời gian có hiệu lực ngắn (2-5 giờ), do đó cần thiết phải tăng thêm các lần tiêm, chi phí sản xuất cao, số lượng không ổn định, nhưng chúng có ưu điểm là sản sinh ra một số lượng lớn phôi có chất lượng tốt.
Trong nhân y người ta có thể sử dụng HMG (Human MenopHusal Gonadotropine) để gây siêu bài noãn và kết quả thu được cũng tương đương như sử dụng PMSG, nhưng nó có nhược điểm là đắt tiền.
Xử lý có thể bắt đầu từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 của chu kỳ động dục. Người ta thường sử dụng 2 hormon là: PMSG và FSH tuyến yên của lợn để gây siêu bài noãn ở bò. Sơ đồ gây siêu bài noãn như sau:
a/ Gây siêu bài ngón bằng PMSG
* Sơđồ xử lý theo quy trình của Pháp và các nước châu Âu
Ngày thứ 8 của chu kỳ: Tiêm bắp từ 2000 - 3000 IU PMSG/ con Ngày thứ 10 của chu kỳ: Tiêm prostagladin
Ngày thứ 12 của chu kỳ: Sau khi đã tiêm prostagladin được 48-60 giờ, cho động vật giao phối trực tiếp hoặc thụ tinh nhân tạo.
cần tiến hành lặp lại vì sự rụng trứng diễn ra không đồng thời mà kéo dài trong một khoảng thời gian nhất định. Tuy nhiên, xu hướng hiện nay là giảm số lần thụ tinh nhân tạo để tránh sự can thiệp quá nhiều vào cơ quan sinh dục cái. Sau khi thụ tinh, việc thu hoạch những trứng đã được thụ tinh diễn ra vào ngày thứ 7-8 sau lần thụ tinh nhân tạo cuối cùng.
* Sơđồ xử lý theo quy trình của Việt Nam
Liều lượng PMSG dùng gây siêu bài noãn phụ thuộc vào khối lượng cơ thể bò, dao động từ 1500 - 3000 UI/con (thường gấp từ 1,5 - 1,8 lần liều gây động dục)
Sơđồ 1
Ngày 0 Động dục
Ngày 10 Tiêm PMSG
Ngày 12 Tiêm PGF2a
Ngày 14 Động dục, phối giống, tiêm anti-PMSG
Ngày 20-21 Thu hoạch phôi
Do hàm lượng progesteron trong máu trước khi tiêm PMSG tương quan dương với số và chất lương phôi (ở bò trước khi tiêm PMSG, hàm lượng này phải đạt 3 nghìn). Vì vậy, trong thực tế trước khi tiêm PMSG người ta cần đưa một hàm lượng progesteron vào cơ thể bằng viên cấy dưới tai (Norgestromet) hoặc dụng cụ đặt âm đạo [PRID (Progesteron Releasing Intravaginal Device) hoặc CIDR (Controlled Intemal Dụm Releasing)] trong thời gian từ ngày 9-12 của chu kỳ theo các sơ đồ 2 và 3 dưới đây:
Sơđồ 2
Ngày 0 Đặt dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy chứa progesteron
Ngày 9 Tiêm PMSG
Ngày 11 - 12 Lấy dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy chứa progesteron Ngày 14 Động dục, phối giống, tiêm anti-PMSG
Ngày 21-22 Thu hoạch phôi
Sơđồ 3
Ngày 9 Đặt dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy chứa progesteron Ngày 15-16 Tiêm PMSG, tiêm PGF2a
Ngày 18 Lấy dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy chứa progesteron ra Ngày 20 Động dục, phối giống, tiêm anti-PMSG
Ngày 27-28 Thu hoạch phôi
b/ Gây siêu bài ngón bằng FSH (chất chiết từ tuyến yên của lợn)
những liều nhỏ, sử dụng giảm dần trong những ngày tiếp theo. FSH có thể được đưa vào cơ thể bắt đầu từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 của chu kỳ động dục và được thực hiện theo sơ đồ sau:
* Sơđồ xử lý (theo quy trình của Pháp và các nước châu Âu)
Liều lượng Ngày của chu kỳ Thời gian tiêm
32 mg 50 mg Sáng 5 mg 14 mg 10 Chiểu 5 mg 9 mg Sáng 4 mg 8 mg 11 Chiều 4 mg 5 mg Sáng 3 mg 4 mg + PGF2α 12 Chiều 3 mg 4mg Sáng 2 mg 3 mg 13 Chiều 2 mg 3 mg Sáng 2 mg (động dục) động dục 14
Chiều 2 mg (thụ tinh nhân tạo)
15 Sáng thụ tinh nhân tạo
Thu hoạch phôi sau khi thụ tinh nhân tạo lần cuối từ 7-8 ngày.
Hiện nay, người ta có xu hướng dùng liều 32 mà trong 4 ngày với tỷ lệ 4 mg/lần và ngày tiêm 2 lần (sáng và chiều). Prostagladin được tiêm vào ngày thứ 3 của xử lý (ngày thứ 12 của chu kỳ động dục).
* Sơđồ xử lý theo quy trình của Việt Nam
Do thời gian bán hủy của FSH trong cơ thể ngắn (2 - 5 giờ), nên khi sử dụng gây siêu bài noãn người ta tiêm liên tục cho bò từ 3 - 5 ngày (trung bình là 4 ngày), mỗi ngày 2 lần, cách nhau 12 giờ.
Liều lượng FSH sử dụng cho bò phụ thuộc vào khối lượng cơ thể (dao động từ 20 - 50 mg). Liều lượng mỗi lần tiêm có thể bằng nhau hoặc giảm dần
Sơ đồ 1
Ngày của chu kỳ Thời gian tiêm Liều FSH giảm đần Liều FSH bằng nhau
Sáng 7 mg 5 mg 10 Chiều 7 mg 5 mg Sáng 6 mg 5 mg 11 Chiều 6 mg 5 mg Sáng 5 mg + PGF2α 5 mg + PGF2α 12 Chiều 5 mg 5 mg Sáng 4mg 5 mg 13 Chiều 4 mg 5 mg 14 Động dục Động dục
15 Phối giống Phối giống
Giống như PMSG, người ta có thể đưa vào cơ thể bò trước khi tiêm FSH một hàm lượng progesteron ngoại lai dưới dạng viên cấy dưới tai hoặc dụng cụ đặt âm đạo để tăng số lượng trứng và trứng rụng tập trung hơn. Sơ đồ xử lý theo dạng này được trình bày ở sơ đồ 2 và 3 dưới đây:
Sơ đồ 2
Ngày 0 Đặt dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy dưới tai chứa progesteron Ngày 10,11,12,13 Tiêm FSH liều giảm dần (cách nhau 12 giờ)
Ngày 13 Tiêm PGF2α
Ngày 14 Rút dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy ra Ngày 15 Động dục, phối giống
Ngày 21-22 Thu hoạch phôi
Sơđồ 3
Ngày 9 Đặt dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy dưới tai chứa progesteron Ngày 15-18 Tiêm FSH liều giảm dần (cách nhau 12 giờ)
Ngày 16 Tiêm PGF2α
Ngày 18 Rút dụng cụ âm đạo hoặc viên cấy ra Ngày 20 Động dục, phối giống
Ngày 27-28 Thu hoạch phôi
Các xử lý gây siêu bài noãn có thể được thực hiện trong toàn bộ giai đoạn thể vàng nhân tạo, được gây ra bởi những tiền chất sinh ra progesteron (progestagen)
Phương pháp gây siêu bài noãn bằng chất chiết của tuyến yên cho kết quả cao hơn một chút so với sự sử dụng PMSG. Nhưng cho dù phương pháp được sử dụng như thế nào thì kết quả gây siêu bài noãn luôn luôn khá biến động và không ổn định, nó không chỉ phụ thuộc vào liều dùng mà còn phụ thuộc vào cá thể.
Số trứng rụng được gây ra do tác động của các kích thích gây siêu bài noãn có thể biến động một cách đáng kể. Sự biến động này có thể từ 0 đến 50. Một trong những vấn đề mà quá trình gây siêu bài noãn thường gặp là có nhiều trứng sản sinh ra hình thành nên những phôi bị thoái hóa. Khi buồng trứng bị phản ứng quá mức làm cho chúng to lên, thường xuyên có nhiều u nang do thiếu số lượng lớn các noãn bao. Cho đến hiện nay, kỹ thuật gây siêu bài noãn vẫn là một điểm yếu trong cấy truyền phôi. Để khắc phục những phản ứng quá mức của buồng trứng với tác động của PMSG và để thu được một số lượng trứng nhỏ hơn, hợp lý hơn để từ đó có những phôi có thể sử dụng được, ngày nay người ta đã sử dụng huyết thanh anh- PMSG thu được trên cừu. Kháng huyết thanh này được cung cấp với liều 1800 IU/ con qua con đường tiêm tĩnh mạch vào ngày động dục.
Kết quả xử lý gây siêu bài noãn liên tục biến động khác nhau giữa các động vật. Khi nghiên cứu sự lặp lại các kích thích gây siêu bài noãn, các tác giả đã có nhiều ý
kiến khác nhau. Tuy nhiên, các ý kiến nhất trí đạt được là cần một khoảng thời gian 6 tuần giữa 2 lần gây siêu bài noãn liên tiếp. Từ những thử nghiệm đạt được trên những động vật được xử lý một cách hệ thống với khoảng cách 6 tuần, Chupin và Procureur rút ra những kết luận sau:
- 1/3 số động vật cho kết quả rụng trứng giảm dần đến tận lần xử lý thứ 4 - 5, rồi cho kết quả rụng trứng tăng hơn chút ít;
- 1/3 số con khác, không có phản ứng với các chất kích thích gây siêu bài noãn; - 1/3 số còn lại có kết quả rụng trứng tăng rõ rệt.
Chính số động vật cuối cùng này là có ý nghĩa nhất cho việc xây dựng kế hoạch chuẩn bị những con cái cho trứng.
3.3.2. Ở dê, cừu
Huyết thanh ngựa chửa (PMSG), chất chiết của tuyến yên ngựa cái và bò là những chất được sử dụng một cách rất thường xuyên để gây siêu bài noãn ở cừu. Ở cừu cái, PMSG được tiêm dưới da hoặc tiêm bắp từ ngày thứ 11 đến 13 của chu kỳ với liều 750 đến 1000 IU/ con. Ở dê cái, việc tiêm PMSG được thực hiện từ ngày thứ 16 và 18 của chu kỳ. Liều PMSG sử dụng giống như đối với cừu.
Chất chiết của tuyến yên thường được sử dụng là chất chiết tuyến yên của ngựa, nó được sử dụng trong cùng giai đoạn của chu kỳ động dục. Liều lượng dùng trung bình là 60mg, được chia thành 3 lần tiêm trong 3 ngày liên tiếp. Phương pháp này có bất lợi là cần nhiều thao tác can thiệp. nhưng nó cũng có lợi là giảm được số noãn bao không có trứng.
Sự kết hợp LH, HCG (Human Chorionique Gonadotropin),. GnRH hoặc là những chất tương tự thành những tổ hợp khác nhau với PMSG cho thấy â hiệu quả. Sử dụng kháng huyết thanh PMSG (anti-PMSG) từ 2-3 ngày sau khi tiêm PMSG làm giảm tỷ lệ noãn bao không có trứng. Phản ứng đáp lại của buồng trứng với các xử lý này thay đổi theo loài và ngay trong cùng loài cũng phụ thuộc vào giống.
Kỹ thuật xử lý gây siêu bài noãn bằng các tổ hợp của LH, HCG và GnRH với PMSG ở cuối giai đoạn thể vàng không cho phép xác định chính xác thời điểm rụng trứng và từ đó không xác định chính xác thời điểm cho giao phối hoặc thụ tinh nhân tạo Để khắc phục nhược điểm này, người ta phải dùng đến prostagladin để gây động dục đồng pha. Prostagladin được tiêm vào ngày thứ 2 sau khi tiêm PMSG và động dục sẽ xảy ra trong thời gian 36- 48 giờ sau khi tiêm prostagladin. Cần phải lưu ý rằng, tác động phá hủy thể vàng của prostagladin ở cừu, cũng như ở các loài động vật khác không xảy ra hoặc là xảy ra bất bình thường trong thời gian 5 ngày sau động dục. Như vậy, xử lý nên làm sau giai đoạn này.
Giao phối tự nhiên hay thụ tinh nhân tạo nên làm ở lúc bắt đầu có các biểu hiện động dục. Việc làm đồng pha chu kỳ động dục giữa động vật cho và nhận càng hoàn thiện càng tốt. Sự chậm trễ về thời gian động dục của con nhận không được vượt quá 48 giờ so với con cho phôi.
3.3.3. Ở ngựa
PMSG là hormon được sản sinh ra bởi ngựa cái từ ngày chửa thứ 45 - 120. Nó không có bất cứ hiệu quả nào để gây ra sự kích thích nang trứng trong loài này. Điều này không có gì ngạc nhiên, nếu không, những buồng trứng ngựa chửa sẽ chịu sự tăng tiết của các hormon này và chịu sự kích thích quá mức trong tháng đầu tiên của thời kỳ có chửa. Vì vậy, người ta phải sử dụng những chất chiết của tuyến yên như là một