2.1. Chuẩn bị dung dịch dội rửa phôi và nuôi phôi ngoài cơ thể
Để khai thác phôi, người ta phải dội rửa sừng tử cung và ống dẫn trứng của động vật cho phôi. Dung dịch dội rửa, nuôi, bảo quản phôi và điều kiện môi trường nuôi phôi ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ đậu thai sau khi cấy. Vì vậy, môi trường dội, rửa, nuôi cấy phôi phải đạt các yêu cầu sau:
Bảng 6.1. Yêu cầu của môi trường dội rửa và nuôi cấy phôi
Chỉ tiêu Yêu cầu
pH 7,2-7,6
Áp suất thẩm thấu 270 - 310 mOsm/kg
Độ ẩm 100%
Nhiệt độ Nhiệt độ phòng 15-20oC hoặc 37oC trong tủ ấm
Dung dịch đệm Có con photphat hoặc bicacbonat (sau này có thể duy trì dưới áp suất 5% CO2)
Khử trùng Lọc môi trường (Meơium) qua hệ thống màng lọc có kích thước 0,22µ. Vô khuẩn bằng bổ sung các chất kháng sinh (Penicilline G và Streptomocine Sulfate)
Chất phân tử lớn (Macromolecule)
Thêm vào môi trường huyết thanh bê (FCS) hoặc Albumin huyết thanh bò (BSA) đã được khử trùng
Hiện nay, môi trường dội rửa, thu hoạch phôi bò là dung dịch photphat hoặc bicacbonat, trong đó đệm PBS (Photphat Buffered Salin) được sử dụng nhiều hơn cả. Dung dịch này lần đầu được Dulbecco và vượt đề nghị sử dụng năm 1954. Trên cơ sở dung dịch này, ngày nay các nước đã có sự thay đổi ít, nhiều để phù hợp với yêu cầu của các giống gia súc hoặc các tế bào, tổ chức khác nhau.
Thành phần dung dịch D-PBS (Dulbecco's Photphat Buffered Salin) đã được thay đổi ít nhiều theo một số tác giả, được trình bày ở bảng 6.2
Quy trình pha và hỗn hợp các chất trên tạo thành dung dịch PBS như sau:
- Hòa tan NaCl, KCI, Na2HPO4.KH2PO4 trong 8 lít nước cất 2 lần (tốt nhất là nước cất 3 lần) vào bình có dung tích 12-15 lít
- Hòa tan dần từng chất : CaCl2 và MgCl2 hoặc MgSO4 trong 2 lít nước cất như trên vào trong bình có dung tích 3 lít, lắc đều, khuấy mạnh, tránh kết tủa.
- Khử trùng trong Autoclave (1150C, 1atm) trong 10 - 15 phút. Để nhiệt độ dung dịch giảm xuống 30 - 40oC (hoặc nhiệt độ phòng), trộn 2 hỗn hợp trên với nhau. Chú ý là đổ hỗn hợp 2 lít vào hỗn hợp 8 lít, không làm ngược lại. Khuấy đều để tránh kết tủa. Khi đổ phải nhẹ nhàng. Nếu trộn hỗn hợp lúc còn nóng hoặc quá nhanh sẽ tạo ra kết tủa lắng đọng lại, không tốt.
- Bổ sung Na pyruvat, glucose, streptomycin và penicillin G vào hỗn hợp trên, khuấy đều, không lắc mạnh tránh kết tủa
- Hỗn hợp trên được đóng vào túi ngon hoặc vào chai, sau đó được bảo quản trong buồng lạnh. Thời gian có thể sử dụng từ 1 tuần đến hàng năm tùy theo quá trình bảo tồn. Nếu trong quá trình bảo tồn, dung dịch kết tủa hoặc lắng đọng thì không nên dùng.
- Khi sử dụng để dội rửa phôi phải bổ sung 1 % huyết thanh bê (FCS) hoặc 1 -2 g albumin huyết thanh bò (BSA)/1 lít dung dịch.
- Khi sử dụng để nuôi cấy, làm đông lạnh, hoặc cấy truyền cần bổ sung vào dung dịch gốc nói trên 10-20% FCS hoặc 4 g BSA/ lít dung dịch.
Bảng 6.2. Thành phần dung dịch PBS (trong 10 lít dung dịch)
Số lượng (g) Thành phần Vlahov và CS, 1987 Hafez, 1987 Seidel.E và M.Seidel,1991 Norio Saito, 1994 CaCl2 - - - 1 ,00 CaCl2.2H2O 1,32 1,32 1,32 - MgSO4.7 H2O - 1 ,21 1,21 - MgCl2.6 H2O 1,00 - - 1 ,00 NaCl 80,00 80.00 80.00 80,00 KCI 2,00 2,00 2,00 2,00 Na2HPO4 11, 50 11, 50 11,50 11,50 KH2PO4 2,00 2,00 2.00 2,00 Glucose 10,00 10,00 10,00 10,00 Na pyruvat 0,36 0'36 0,36 0,36 Streptomycin S l 0,50 0 50 0 50 0,50
Na Penicillin G 1 triệu UI 1 triệu UI 1 triệu UI 1 triệu UI Hiện nay, có nhiều công ty chuyên sản xuất, buôn bán các loại môi trường trên, như: ICP của New Zealand, AB Technology của Mỹ, IMV của Pháp... Các môi trường có thể bao gói dưới dạng khô cho từng loại 1 , 3 , 5 hoặc 10 lít, cũng có dạng dung dịch được đóng vào chai, bình, túi ngôn từ 100-1000 ml. Trước khi dùng chỉ cần bổ sung 10-20% FCS để dội rửa hoặc nuôi cấy phôi.
2.2. Dụng cụ khai thác phôi (dội rửa phôi)
Khi dội rửa thu hoạch phôi cần có một số dụng cụ khai thác phôi (lấy phôi). Tùy vào phương thức dội rửa và kích thước tử cung động vật cho phôi mà sử dụng dụng cụ lấy phôi có kích cỡ phù hợp. Dụng cụ lấy phôi gọi là foley catheter.
rộng rãi. Có nhiều loại foley catheter được sử dụng, nhưng có hiệu quả cao là foley catheter có 2 hoặc 3 đường dẫn của hàng IMV (Cassou- Pháp) và foley catheter có 2 đường dẫn của Wlly Rush của hãng Minitub-Đức.
2.3. Khai thác phôi ở một số loài vật nuôi 2.3.1. Ở bò
Hiện nay, trên thực tiễn, khai thác phôi bò được thực hiện vào ngày thứ 7-8 sau khi thụ tinh hoặc ở giai đoạn mà trứng được thụ tinh đạt tới thời kỳ phôi dâu hoặc túi phôi. Có 2 phương pháp khai thác phôi bò đang được sử dụng: Phương pháp phẫu thuật (ít được sử dụng) và phương pháp không qua phẫu thuật (được sử dụng phổ biến)
* Phương pháp phẫu thuật
Phương pháp này được tiến hành thông qua việc phẫu thuật cơ đường trắng. Tuy nhiên, một vài tác giả đã khuyên dùng thủ thuật mở bụng ở cạnh sườn, một số tác giả khác đề nghị khai thác phôi qua cổ tử cung. Trên thực tế, phương pháp khai thác phôi qua cạnh sườn và qua cơ tử cung ít được sử dụng.
Để khai thác phôi bằng phẫu thuật, người ta để đói động vật trước khi phẫu thuật 48 giờ, trước khi can thiệp 15 phút, động vật được gây mê bằng cách tiêm xylazine (Rompun ở tỷ lệ lmllloo kg khối lượng sống). Sau đó, tiêm pentothal vào trong tĩnh mạch (lg/100kg), để động vật ở trạng thái nằm, luồn ống gây mê vào khí quản. Gây mê được thực hiện dưới tác dụng của Fluothane. Để phòng ngừa sự trướng bụng có thể xảy ra nên bố trí một ống thông khí quản. Để con vật nằm ngửa, tiệt trùng và cạo lông
vùng bụng phía dưới. Sau khi chuẩn bị được vùng phẫu thuật, rạch một đường trên cơ đường trắng ở phía trước vú, có thể ở giữa hai hàng vú. Đường rạch này được thực hiện trên toàn bộ cơ bụng và màng bụng với chiều dài khoảng 12 - 15 cm. Khi tử cung được bộc lộ ra, người ta cố định tử cung ở điểm phân chia các sừng tử cung bằng ngón trỏ và xiết chặt một sừng tử cung nhờ ngón cái và ngón giữa. Sừng tử cung được kẻo ra ngoài và bị rạch với chiều dài 1 cm, đúng trước chỗ các đôi. Vết rạch này cho phép đưa vào trong tử cung một catheter có 1 đầu hình cầu bằng màng mỏng có thể co giãn. Đầu của ống thông này khi được bơm căng phồng lên có tác dụng bịt kín tử cung. Người ta bơm vào đỉnh sừng tử cung khoảng 150ml dung dịch rửa PBS nhờ một bơm tiêm. Chất lỏng này có tác dụng tráng rửa sừng và khoang tử cung, sau đó chất lỏng này được lấy ra nhờ ống thông. Sau khi khai thác phôi, quả bóng hình cầu ở đầu ống thông được làm xẹp xuống, ống thông được lấy ra và thành tử cung được khâu lại Người ta cũng thực hiện như vậy trên sừng tử cung bên kia.
Cũng cần thấy rằng, phần lớn phôi nằm ở ống dẫn trứng 4 ngày sau khi thụ tinh, 1 ngày ở đoạn nối giữa ống dẫn trứng với sừng tử cung, ngày thứ 6 trứng nằm ở chóp sừng tử cung. Như vậy, để thu hoạch phôi từ ngày 1-4 sau khi thụ tỉnh, cần dội rửa ống dẫn trứng, ngày thứ 5, dội rửa đoạn nối ống dẫn trứng với sừng tử cung và từ ngày thứ 6 trở đi, dội rửa chóp sừng tử cung.
Từ sự hiểu biết về quá trình di chuyển của phôi trong ống dẫn trứng và sừng tử cung, ngoài phương pháp thu hoạch phôi được trình bày ở trên, người ta còn đưa ra các phương pháp thu hoạch phôi dựa trên vị trí của phôi trong đường sinh dục cái, như sau:
+ Phương pháp 1 : Đưa dung dịch dội rửa phôi vào chóp sừng tử cung và lấy ra ở
được lấy ra theo một ống nhỏ lồng vào loa kèn chảy xuống đĩa petri. Trứng, phôi theo dòng chảy được đưa ra ngoài.
Phương pháp này có ưu điểm là lượng dung dịch dội rửa ít (5-15 ml và ít làm tổn thương đến ống dẫn trứng. Kết quả thu hoạch phôi đạt tỷ lệ cao, phần lớn trứng và phôi được đẩy ra ngoài.
+ Phương pháp 2: Đưa dung dịch dội rửa vào loa kèn, dung dịch dội rửa chảy ra
ở gốc ống dẫn trứng (chóp sừng tử cung). Trứng, phôi theo dòng nước rửa này chảy từ loa kèn đến gốc ống dẫn trưng và chảy ra ngoài theo ống đã được lồng sẵn vào gốc ống dẫn trứng.
Ưu điểm của phương pháp này là tốn ít dung dịch dội rửa (5-15 ml), tỷ lệ trứng, phôi thu hoạch cao, nhưng có nhược điểm là làm tổn thương hơn phương pháp 1 do phải rạch một vết ở chóp sừng tử cung khi đưa catheter vào lấy dung dịch dội rửa ra.
Tuy nhiên, dù khai thác như thế nào, phương pháp phẫu thuật cũng có những bất lợi là khó áp dụng trên gia súc tiết sữa do sự phát triển to của bầu vú và chỉ được thực hiện một số ít lần trên cùng một cá thể do phản ứng của màng bụng. Ngoài ra, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và đắt tiền.
* Phương pháp không phẫu thuật
Nguyên tắc chung của phương pháp là đưa foley catheter qua âm đạo, cổ tử cung vào đến sừng tử cung. Cố định foley catheter tại một vị trí nhất định bằng một bóng khí sau đó đưa dung dịch dội rửa vào và lấy ra theo một hệ thống ống dẫn khép kín hoặc trực tiếp bằng xi lanh qua foley catheter. Dung dịch được bơm vào và hút ra như vậy đã dội rửa bên trong tử cung, kéo theo cả trứng và phôi.
Phương pháp này được tiến hành vào ngày thứ 6-9 sau khi phối tinh (tốt nhất vào ngày thứ 7-8). Sự phát triển của phôi ở giai đoạn này rất thích hợp cho cấy truyền và làm đông lạnh. Vào thời gian này phần lớn phôi có mặt bên trên sừng tử cung. Trình tự của khai thác phôi không qua phẫu thuật như sau:
a/ Chuẩn bị:
- Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết cho khai thác phôi (foley catheter, thuốc gây tê cục bộ, dung dịch dội rửa, găng tay, thuốc sát trùng...).
- Đưa bò vào giá cố định (địa điểm khai thác phôi có thể cố định hoặc thay đổi). Chú ý để 2 chân trước của bò đứng cao hơn 2 chân sau để dễ dàng thao tác
- Khám và xác định vị trí, kích thước, đặc biệt là độ dài của tử cung trong cơ thể. Xác định số lượng thể vàng, nang trứng trên buồng trứng.
Chuẩn bi sẵn 1000 ml dung dịch dội rửa phôi. Ngâm hoặc sưởi ấm dung dịch lên 37oC. Nối các hệ thống dung dịch đi vào và đi ra với các bình đựng và bình hứng dung dịch dội rửa (bình đựng dung dịch dội rửa đi vào đặt ở vị trí cao hơn)
- Vệ sinh phần âm hộ, hậu môn và đuôi bò
mê ngoài màng cứng bằng 3 ml xylocain nồng độ 2%. Lấy hết phân và các chất chứa trong trực tràng. Tiệt trùng âm đạo và đáy xoang chậu.
b/ Đưa foley catheter vào và cốđịnh nó trong tử cung
- Lau khố, sạch âm đạo và sau đó lau lại bằng cồn 70o
- Khi tử cung được làm giãn bằng những cái "nong", một người mở âm hộ bò. Kỹ thuật viên (người thao tác dội rửa) đưa foley catheter vào qua âm đạo, cổ tử cung đến sừng tử cung (mọi thao tác giống như thụ tinh nhân tạo). Kích thước fuley catheter tùy thuộc vào độ to, nhỏ, dài, ngắn của tử cung bò cho phôi (loại 14, 16 G cho bò tơ, loại 18, 20 cho bò sinh sản). Hệ thống catheter trước khi sử dụng phải hấp tiệt trùng
- Foley catheter sau khi được đưa vào sừng tử cung, vị trí bóng khí của nó khi cố định phải cách chỗ rẽ của thân và sừng tử cung. Vị trí này sâu hơn đối với bò sinh đẻ nhiều, tử cung to và dài. Đối với bò cái tơ, người ta làm giãn cơ tử cung bằng những cái "nong" đường kính tăng dần. Những cái "nong" này là những ống đơn bằng kim loại có đầu tròn. Kỹ thuật viên phải thao tác nhẹ nhàng, tránh gây tổn thương, viêm nhiễm cơ quan sinh dục.
Khi xác định đúng vị trí của phôi cần cố định foley~catheter (bơm khí và xả khí để xác định vị trí) , bơm 10- 15 ml khí, bóng khí sẽ nổi lên . Kỹ thuật viên có thể cảm nhận được mức độ to nhỏ của bóng khí so với tử cung để thêm vào hay bớt đi số lượng tương ứng để không cho dung dịch dội rửa chảy ra ngoài, đồng thời không làm chảy máu, tổn thương niêm mạc tử cung vì bóng khí quá to, chèn ép. Thông thường đối với bò cái tơ, lượng không khí là 12- 14 ml, bò sinh sản là 14- 18 ml.
c/ Dội rửa
- Sau khi cố định foley catheter, nối foley catheter với hệ thống ống cho dung dịch rửa vào và ra. Trước khi nối phải cho hệ thống này đầy dung dịch đội rửa và kiểm tra các khóa đóng mở.
- Khi nối xong đóng khóa dung dịch chảy ra, mở khóa dung dịch chảy vào. Dung dịch chảy vào sừng tử cung
- Khi tử cung đã đầy dung dịch, kỹ thuật viên đóng khóa và mát - xa nhẹ cổ tử ung, sau đó mở khóa ra, dung dịch sẽ được chảy ra vào bình đựng hoặc phễu lọc
- Lượng dung dịch mỗi lần vào, ra khoảng 20-50 ml tùy kích thước tử cung, vị trí bóng khí. Tốt nhất lần rửa đầu tiên chỉ 20-30 ml, sau đó tăng dần lên 40-50 ml.
- Lặp đi, lặp lại khoảng 8-10 lần rửa. Tống lượng dung dịch chảy vào và ra khoảng 400-500 mi là đủ cho 1 lần lấy phôi ở 1 sừng tử cung
- Nếu không dùng hệ thống đường vào, đường ra theo dạng bình thông nhau như trên, người ta có thể dùng xi lanh bơm dung dịch dội rửa vào. Sau khi đã mát-xa nước tự động chảy ra hoặc được hút bằng một xi lanh khác. Khi bơm dung dịch vào nên bơm từ từ với số lượng tăng dần từ 20-30 ml, rồi tăng lên 40-50 ml
- Sau khi đã dội rửa sừng tử cung thứ nhất, kỹ thuật viên rút foley catheter rá và tiếp tục lắp đặt và dội rửa với sừng tử cung bên kia. Quá trình thao tác được lặp lại như sừng tử cung thứ nhất.
Sau khi khai thác phôi xong, người ta đưa vào xoang tử cung 20 ml dung dịch penicillin + streptomycin. Tỷ lệ phôi được thu hoạch bằng kỹ thuật này đạt khoảng 50- 80%. Phương pháp này có ưu điểm là thiết bị ít phức tạp, không cần thiết nhiều thời gian, có thể lặp lại nhiều lần ở cùng một con vật mà không gây ra những ảnh hưởng bất lợi đến cơ thể. Phương pháp này có thể được áp dụng ở mọi trang trại và không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại.
d/ Soi tìm phôi
Sau khi được dội rửa ra ngoài, phôi dễ chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, dinh dưỡng, vô trùng của dung dịch nuôi... Vì vậy, phải soi tìm phôi càng nhanh càng tốt. Nếu thấy phôi, phải chuyển nhanh vào dung dịch nuôi dưỡng vô trùng đã bổ sung 10-20% FCS. Nếu dung dịch chảy ra thông qua phễu lọc phôi, có thể tiến hành soi phôi ngay trên hệ thống lọc hoặc đổ ra đĩa petri. Nếu dung dịch rửa phôi chảy ra đựng vào bình (thường là bình hít), có thể thực hiện soi tìm phôi theo 2
- Phương pháp thanh lọc liên tục:
Mục đích của thanh lọc là giảm nhanh số lượng dung dịch dội rửa đã thu được và tiến hành soi tìm phôi ngay. Có nhiều loại dụng cụ lọc phôi như đụng cụ của hãng