Tương tự như phương pháp tređn, khuêch tán qua giêng thách (well diffusion assay) là phương pháp đánh giá ạnh hưởng các sạn phaơm trao
4.5. Thí nghieơm xác định khạ naíng đôi kháng baỉng phương pháp Turbidimetric assay (đo đoơ đúc)
Turbidimetric assay (đo đoơ đúc)
Tê bào vi sinh vaơt là moơt thực theơ neđn khi hieơn dieơn trong mođi trường làm cho mođi trường trở neđn đúc. Đoơ đúc cụa huyeăn phù tư leơ thuaơn với maơt đoơ tê bào. Do đó, thođng qua vieơc đo đoơ đúc baỉng máy quang phoơ keơ ở bước sóng nhât định cụa dịch huyeăn phù tê bào ta có theơ định tính được maơt đoơ tê bào ở đieău kieơn caăn khạo sát.
Khi thực hieơn phương pháp đo đoơ đúc, chúng tođi có thay đoơi quy trình so với tài lieơu tham khạo [16], [31]. Thay vì tieơt trùng dịch ly tađm baỉng phương pháp lĩc, chúng tođi khử trùng trước eppendorf tube dùng đeơ ly tađm, sau ly tađm chư thanh trùng Pasteur ở 80o C 10 phút đeơ tránh biên tính bacteriocin và đơn giạn hóa thao tác. Mĩi thao tác cây truyeăn đeău được bạo đạm đieău kieơn vođ trùng.
Phương pháp này văn dựa tređn nguyeđn taĩc chung cụa các phương pháp phát hieơn chât kháng vi sinh vaơt là đo khạ naíng ức chê taíng trưởng cụa vi khuaơn chư thị cụa các chât kháng khuaơn được sinh ra từ quá trình trao đoơi chât cụa vi khuaơn leđn men lactic. Khođng giông như bôn phương pháp đã thực hieơn ở tređn, phương pháp đo đoơ đúc dựa tređn sự khuêch tán các chât kháng khuaơn trong mođi trường lỏng. Tư leơ phaăn traím OD E. coli ụ với dịch ly tađm tê bào vi khuaơn LAB so với OD E. coli
ụ với đôi chứng (thay dịch ly tađm LAB baỉng mođi trường MRS cùng theơ tích) cho ta tư leơ sông sót cụa E. coli sau khi ụ với các chât kháng khuaơn trong dịch nuođi cây tê bào LAB. Như vaơy bieđn đoơ thay đoơi cụa các giá trị đo được và tính được roơng hơn so với phương pháp well diffusion assay (Hình 4.5 và Bạng 4.2).
Cũng tređn cơ sở phương pháp này có nhieău ưu đieơm so với các phương pháp trước, ngoài vieơc khạo sát hốt tính kháng khuaơn toơng quát, chúng tođi bước đaău tìm hieơu bạn chât kháng khuaơn trong dịch nuođi cây vi khuaơn LAB ly tađm.
Thực hieơn quá trình nuođi cây vi khuaơn leđn men lactic trong MRS lỏng với đieău kieơn kị khí, dịch nuođi cây đem phađn tích hàm lượng H2O2 sinh ra. Kêt quạ cho thây H2O2 khođng được sinh ra trong quá trình nuođi cây kị khí, như vaơy hai chât kháng khuaơn đáng quan tađm còn lái là acid hữu cơ và bacteriocin. Đeơ lối bỏ tác dúng cụa acid hữu cơ trong hốt tính kháng khuaơn, chúng tođi tiên hành trung hòa dịch nuođi cây LAB roăi mới đem ly tađm tiêp đó tiên hành quy trình đo đoơ đúc như tređn.Kêt quạ cũng được trình bày trong bạng 4.2.
Ông nghieơm beđn phại: Dịch nuođi cây C1 ly tađm (khođng trung hòa) ụ với E.
coli
Ông nghieơm beđn phại: Dịch nuođi cây C1 ly tađm (sau khi trung hòa) ụ với E.
coli
Ông nghieơm beđn trái : đôi chứng (thay dịch nuođi cây C1 baỉng mođi trường MRS cùng theơ tích)
SVTH: Đoê Queđ Mi Hương
Hình 4.5: Kieơm tra hốt tính baỉng phương pháp đo đođ đúc
Bạng 4.2. Tư leơ sông sót cụa E. coli sau khi ụ với dịch nuođi cây LAB ly tađm
Sô TT
Chụng vi khuaơn
lactic
Tư leơ sông sót cụa E.coli (%) khi ụ với dịch ly tađm khođng trung
hòa
Tư leơ sông sót cụa E.coli (%)
khi ụ với dịch ly tađm sau khi
trung hòa 1 T8b 4.6 56.1 2 C1 4.1 52.7 3 T1a 3.2 62.1 4 T7b 4.5 57.1 5 D3 15.3 80.1 6 N3 4.2 63.2 7 T1c 48.2 74.3 8 T3c 20.0 68.8 9 S6 34.3 63.4 10 N4 41.9 67.9 11 S2 12.3 76.8 12 S4 34.0 54.3 13 N1 15.8 55.8 14 T2c 63.2 63.5 15 N5 48.1 65.6 16 S1a 45.7 58.0 17 S1b 85.1 76.0 18 S3 46.5 58.1 19 T1b 92.6 80.3 20 D2 57.0 57.6 21 T4c 89.5 77.5 22 S5 53.2 73.5
Từ bạng 4.2 ta có theơ thây raỉng tư leơ sông sót cụa E. coli càng thâp thì hốt tính kháng vi sinh vaơt càng cao. Như vaơy đeơ so sánh trực tiêp khạ naíng ức chê taíng trưởng E. coli cụa các sạn phaơm trao đoơi chât vi khuaơn LAB, chúng tođi sử dúng đái lượng (100% – tư leơ % sô sót cụa E. coli) và bieơu dieên tređn đoă thị 4.1.
Đoă thị 4.1: Tư leơ ức chê taíng trưởng E. coli cụa dịch nuođi cây vi khuaơn lactic ly tađm khođng trung hòa và sau khi trung hòa
Đoă thị 4.1 cho thây:
- Tư leơ ức chê taíng trưởng vi sinh vaơt chư thị cụa dịch nuođi cây LAB ly tađm khođng trung hòa thường lớn hơn mău tương ứng sau khi trung hòa (19/22 trường hợp) Đieău này hợp lý vì trung hòa nhaỉm lối bỏ tác dúng cụa acid hữu cơ trong hốt tính kháng khuaơn. Trường hợp S1b, T1b và T4c cho kêt quạ ngược lái. Tuy nhieđn các chụng này khođng gađy chú ý đaịc bieơt vì tư leơ ức chê E. coli cao
nhât xâp xư 20%, thuoơc lối thâp nhât so với các chụng còn lái.
SVTH: Đoê Queđ Mi Hương
- Nhieău chụng có theơ ức chê tređn 80% taíng trưởng cụa E. coli khi khođng trung hòa (T8b, C1, T1a, N3, S2, N1), nhưng sau khi lối bỏ tác dúng cụa acid hữu cơ táo thành thì khạ naíng ức chê còn lái tređn dưới 40%. Nhieău chụng hốt tính kháng E. coli lái khođng phại do acid hữu cơ táo thành mà chụ yêu do yêu tô khác, rât nhieău khạ naíng là do bacteriocin (T2c, N5, S1a, D2) và hốt tính này cũng xâp xư 40%.
So sánh với kêt quạ phương pháp khuêch tán trong giêng thách (well diffusion assay) nhìn chung ta có theơ phađn bieơt những chụng có hốt tính mánh và yêu baỉng cạ hai phương pháp, ví dú moơt sô chụng được đánh giá là có hốt tính mánh trong well diffusion assay ức chê tređn 90% taíng trưởng E. coli (mău khođng trung hòa). Ngược lái nhieău chụng làm giạm đoơ đúc E.coli tương tự nhưng beă dày vành kháng khuaơn lái nhỏ (T3c, S2, N1). Có vẹ raỉng những chụng ức chê taíng trưởng vi sinh vaơt chư thị càng mánh do tác đoơng cụa acid hữu cơ thì beă dày vành kháng khuaơn càng lớn. Có theơ đó là do khạ naíng khuêch tán cụa bacteriocin trong mođi trường thách kém hơn acid hữu cơ. Đoă thị 4.2 bieơu dieên tương quan giữa tư leơ sông sót E. coli (A%) theo phương pháp đo đoơ đúc theo beă roơng vành kháng khuaơn (mm) với sô lieơu xử lý và đoă thị vẽ baỉng phaăn meăm Statgraphics.
Đoă thị 4.2: Sự tương quan giữa phương pháp đo đoơ đúc (turbidimetric assay method) và phương pháp khuêch tán qua giêng thách (well diffusion assay)
Phương trình bieơu dieên tương quan là:
A(%) = 24.2 + 14.7 D được thiêt laơp với heơ sô tương quan (correlation coefficient) là 0.8366 và R2 = 66.3 %.
Như vaơy, veă maịt thông keđ coi như khođng có sự tương quan giữa kêt quạ cụa hai phương pháp khuêch tán qua giêng thách đo đoơ đúc.
Tóm lái, phương pháp khuêch tán qua giêng thách chư cho kêt quạ định tính lái tôn nhieău thời gian và cođng phu, còn phương pháp đo đoơ đúc cho kêt quạ mang tính định lượng hơn vì vaơy có theơ deê dàng sử dúng đeơ đánh giá hốt tính kháng vi sinh vaơt cụa các thành phaăn chât kháng khuaơn. Chúng tođi đeă nghị phát trieơn phương pháp này trong Phòng thí nghieơm trong cođng vieơc tuyeơn chĩn các chụng LAB làm probiotics hay sạn xuât bacteriocin.
SVTH: Đoê Queđ Mi Hương