4.1. Kieơm tra khạ naíng đôi kháng baỉng phương pháp Spot on lawn
Phương pháp này có dáng giông chiêc bánh Sandwich với 2 maịt kép là mođi trường MRS agar và BHI agar, khạ naíng kháng vi sinh vaơt chư thị dựa tređn sự tiêp xúc trực tiêp giữa chúng với vi khuaơn lactic. Theo nghieđn cứu cụa Carherine B. Lewus và Thomas J. Montville (1991) vòng kháng khuaơn theơ hieơn rât rõ ràng với khạ naíng laịp lái cao và nhanh chóng. Cho đến gần đađy, Bilge H. Cadirci và Sumru Citak (2005) nhận đđịnh rằng phương pháp này dường như cho kêt quạ tôt nhât. Tuy nhieđn, hốt tính kháng vi sinh vaơt ở đađy là hốt tính toơng hợp cụa tât cạ các sạn phaơm cụa quá trình trao đoơi chât cụa vi khuaơn lactic như: acid lactic, acid acetic, diacetyl, bacteriocin…Vì vaơy, đeơ xác định hốt tính rieđng cụa từng chât kháng vi sinh vaơt cụa vi khuaơn lactic caăn có các phương pháp boơ sung. Khi thực hieơn phương pháp này moơt sô khó khaín thường gaịp là:
- Đeơ thực hieơn kieơm tra, ta phại trại moơt lớp mỏng mođi trường MRS, roăi nhỏ moơt lượng nhỏ vi khuaơn LAB leđn tređn beă maịt agar. Sau đó, nhỏ tiêp 1 giĩt mođi trường BHI (0,7% agar) leđn tređn vi khuaơn lactic đeơ cô định chúng tređn beă maịt thách. Nêu lượng mođi trường BHI nhỏ leđn quá lớn sẽ rửa trođi vi khuaơn lactic.
- Đeơ trại moơt lớp mỏng mođi trường BHI 0,7 % agar chứa vi khuaơn chư thị E. coli leđn tređn beă maịt MRS agar đã nhỏ vi khuaơn lactic, ta caăn hóa lỏng mođi trường BHI ở nhieơt đoơ 500 C. Ở nhieơt đoơ này, E.coli deê bị toơn thương và BHI deê hòa lăn với MRS agar. Ngược lái, nêu há nhieơt đoơ thâp hơn, mođi trường deê đođng, khođng táo được lớp mỏng đeău tređn MRS agar như mong muôn.
- BHI agar từ ông nghieơm được chuyeơn sang đĩa petri baỉng cách rót trực tiêp tređn ngĩn lửa đèn coăn, nguy cơ bị nhieêm vi khuaơn hay bào tử từ khođng khí rât cao.
- MRS agar sau khi đoơ đĩa sây khođ 15 phút đeơ beă maịt đĩa khođ, khođng bị đĩng nước tránh bị nhieêm do nước.
Qua thử nghieơm phương pháp này, vì những khó khaín gaịp phại cũng như đieău kieơn tái phòng thí nghieơm khođng thuaơn lợi đeơ thực hieơn, phương pháp này bị tám ngưng đeơ tiên hành phương pháp khác.
4.2. Kiểm tra khạ naíng đôi kháng baỉng phương pháp Agar spot test(khuêch tán tređn beă maịt thách) (khuêch tán tređn beă maịt thách)
Tương tự như phương pháp tređn, đađy là phương pháp kieơm tra khạ naíng kháng vi sinh vaơt chư thị dựa tređn sự tiêp xúc trực tiêp giữa chúng với vi khuaơn lactic. Tuy nhieđn, ở đađy mođi trường BHI được trại trước leđn đĩa Petri và cây giông vi sinh vaơt chư thị. Ngày hođm sau vi khuaơn lactic nuođi trước trong mođi trường MRS mới được nhỏ leđn maịt thách sẽ táo vòng kháng khuaơn xung quanh giĩt vi khuaơn lactic. Tương tự như phương pháp thứ nhât, phương pháp này cũng nhaỉm đánh giá khạ naíng kháng vi sinh vaơt cụa tât cạ các sạn phaơm cụa quá trình trao đoơi chât nhưng quy trình thử nghieơm đơn giạn hơn. Tuy nhieđn văn gaịp khó khaín là:
- Khi lượng vi khuaơn lactic quá ít sẽ khođng đụ ức chê vi sinh vaơt chư thị
- Lượng vi khuaơn lactic quá lớn sẽ tràn tređn maịt thách hòa lăn với E.coli
neđn khođng nhaơn được kêt quạ kháng.
Như vaơy đôi với phương pháp 1 và 2 noăng đoơ vi khuaơn lactic trong dung dịch MRS và noăng đoơ vi sinh vaơt chư thị caăn được tôi ưu hóa đeơ đát kêt quạ thử nghieơm mong muôn.
SVTH: Đoê Queđ Mi Hương
C1
Dịch nhỏ LAB bị tràn tređn beă maịt thách N3
Lượng nhỏ LAB quá ít
T7b
Lượng nhỏ LAB quá ít
T8b
Dịch nhỏ LAB bị traăn tređn beă maịt thách
Hình 4.1: Thử nghiệm khođng thành cođng phương pháp Agar spot test Như vaơy, tái phòng thí nghieơm trường Đái Hĩc Kỹ Thuaơt Cođng Ngheơ, phương pháp này bị tám ngưng đeơ tiên hành phương pháp khác.
4.3. Kiểm tra khạ naíng đôi kháng baỉng phương pháp Disc diffusionassay (khuêch tán qua vòng giây lĩc) assay (khuêch tán qua vòng giây lĩc)
Khác với hai phương pháp tređn, trong phương pháp này vi khuaơn lactic khođng đôi kháng trực tiêp vi sinh vaơt chư thị mà chư có sạn phaơm trao đoơi chât
cụa chúng khuêch tán qua mođi trường thách ạnh hưởng leđn taíng trưởng cụa vi sinh vaơt chư thị. Trong tài lieơu phương pháp này thường được tiên hành song song với moơt trong những phương pháp tređn.
Áp dúng phương pháp này ta có theơ tách rời ạnh hưởng cụa từng yêu tô kháng khuaơn. Ví dú như tác dúng kháng khuaơn cụa acid hữu cơ có theơ lối trừ nhờ trung hòa dịch nuođi cây sau khi ly tađm lối bỏ tê bào; tác dúng cụa H2O2
được lối trừ nhờ xử lý dịch ly tađm với enzyme catalase…. Baỉng cách đó có theơ đánh giá hốt tính kháng khuaơn cụa bacteriocin do vi khuaơn lactic toơng hợp.
Khuêch tán qua vòng giây lĩc (disc diffusion assay) tương tự phương pháp cụa Kirby Bauer thường được sử dúng đeơ kieơm tra tính măn cụa vi sinh vaơt đôi với kháng sinh [9]. Vòng giây thâm được đaịt leđn beă maịt đĩa Petri đã cấy vi sinh vật chỉ thị roăi thâm dịch nuođi cây vi khuaơn lactic li tađm roăi. Tuy nhieđn, khi thử nghieơm phương pháp này đã khođng thành cođng. Kêt quạ theơ hieơn theo như hình 4.4.
T1a T8b
SVTH: Đoê Queđ Mi Hương
C1 T7b
Hình 4.2. Thử ngieơm khođng thành cođng phương pháp Disc diffusion assay Từ kêt quạ này có moơt sô nhaơn xét như sau:
Đoơ hâp thú các chât kháng khuaơn thu được từ dịch ly tađm bị hán chê ở mức 20µl, cho thây lượng chât được dùng đeơ thử hốt tính là quá ít.
Các chât kháng khuaơn được thâm trong giây lĩc có sự khuêch tán leđn mođi trường thách là khođng cao.
Cạ hai nhaơn định này đeău giại thích cho kêt quạ khođng thành cođng.
Tuy phương pháp này có khạ naíng tách rieđng kieơm tra định tính các chât kháng khuaơn (acid lactic, H2O2, bacteriocin…), nhưng qua thử nghieơm nhaơn thây noăng đoơ chât kháng khuaơn được sinh ra là khođng cao, và phương pháp này hán chê veă theơ tích đưa vào giây lĩc. Vì vaơy phương pháp khođng mang lái ý nghĩa cao trong vieơc tách rieđng định tính từng chât.
Như vaơy, tái phòng thí nghieơm trường Đái Hĩc Kỹ Thuaơt Cođng Ngheơ, phương pháp này bị tám ngưng đeơ tiên hành thử nghieơm phương pháp khác.
4.4. Kiểm tra khạ naíng đôi kháng baỉng phương pháp Agar WellDiffusion Assay (khuêch tán qua giêng thách) Diffusion Assay (khuêch tán qua giêng thách)
Phương pháp Agar well diffusion assay hay còn gĩi là phương pháp khuêch tán qua giêng thách, vi sinh vaơt chư thị được trại moơt lớp mỏng tređn beă maịt mođi trường BHI agar, cho dịch nuođi cây LAB (có theơ lây dịch ly tađm) vào giêng,
ngay tái giêng chứa LAB phát trieơn và tiêt các chât đôi kháng với vi khuaơn chư thị, ngaín cạn sự phát trieơn cụa vi khuaơn chư thị xung quanh giêng.