Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý

15 DET0318 200 bp DET0318 484F

2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý

2.2.3.1. Nested-PCR

Các cặp mồi 27F và 1492R hoặc FD1 và RP2 (Bảng 2.2) được sử dụng để nhân toàn bộ gene 16S rRNAtừ DNA tổng số. Sản phẩm PCR được sử dụng làm

khuôn để nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA đặc hiệu cho mỗi nhóm VK KK bằng các cặp mồi khác nhau (Bảng 2.2).

2.2.3.2. DGGE

Các mẫu được xác định có mặt VK KSF và Dehalococcoides tiếp tục được nhân đoạn 16S rRNA đặc hiệu (sử dụng khuôn là sản phẩm PCR gene 16S rRNA đầy đủ) bằng cặp mồi đặc hiệu tương ứng có gắn đoạn GC. Sản phẩm PCR được sử dụng cho quy trình DGGE nhằm xác định sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides trong các lô xử lý.

80 μl sản phẩm PCR nhân đoạn gen đích được tra vào các giếng trên gel DGGE (6% acrylamide (Sigma), 0,1% bisacrylamide (Sigma) với dải nồng độ chất biến tính 20 - 70% urea (Fluka)/formamide (Sigma)). Polyme hóa 13 ml hỗn hợp acrylamide/bisacrylamide bởi 13 μl TEMED (Sigma) và 130 μl ammonium persulfate-APS (Sigma). Công thức pha gel DGGE được trình bày trên Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Công thức pha gel DGGE ở các nồng độ biến tính khác nhau

Công thức pha gel acrylamide/biacrylamide stock

Công thức pha gel acrylamide/Bisacrylamide với các nồng độ biến tính khác nhau Thành phần 0% 100% Thành phần 20% 30% 60% 70% 40% acrylamide/Bis acrylamide (37,5:1) 3 ml 3 ml 0% 12 ml 10,5 ml 6,0 ml 4,5 ml TAE 50X 0,4 ml 0,4 ml 100% 3 ml 4,5 ml 9,0 ml 10,5 ml Formamide 0 8 ml TEMED 10 l 10l 10l 10l Urea 0 8,4 g APS 10% 100 l 100l 100l 100l Nước khử ion Đến 20 ml Đến 20 ml Tổng thể tích 15 ml 15 ml 15 ml 15 ml

Mẫu DNA được điện di trên gel ở 70 V, 23 mA, 60oC, 6 giờ trong đệm TAE 1X trên thiết bị Bio-Rad DCodeTM. Sau khi kết thúc điện di, nhuộm DNA trong gel với EtBr, kiểm tra dưới ánh sáng tia UV và chụp ảnh sử dụng thiết bị và phần mềm của hãng Kodak. Các băng đặc trưng được lựa chọn, cắt và thôi DNA qua đêm trong 40 μl nước cất tiệt trùng ở 4oC. Tiến hành PCR lại với cặp mồi đặc hiệu, điện di kiểm tra trên gel agarose. Sản phẩm PCR được làm sạch với enzym exonuclease

(Exo/SAP cleaning PCR product). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 μl exonuclease I (Exo) (Epicontre), 2 μl shrimp alkaline phosphatase (SAP) (Promega), 0,85 μl đệm SAP 10x (Promega) và 5 μl sản phẩm PCR. Ủ hỗn hợp trên ở 37o

C trong 15 phút và 80oC trong 15 phút tiếp theo. Bảo quản DNA ở 4oC hoặc -20oC đến khi sử dụng để xác định trình tự nucleotide.