Như đã trình bày ở phần trên, các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm khác nhau nên các gene chức năng tham gia vào quá trình
này cũng khác nhau. Thông thường, các phản ứng loại khử clo được xúc tác bởi các enzyme RdhA (reductive dehalogenase). Các gene mã hóa cho enzyme RdhA có mặt ở cả nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, không bắt buộc và loại clo đồng trao đổi chất. Tuy nhiên, chúng có mặt ở 2 nhóm loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc nhiều hơn, ít có mặt ở nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất. Khả năng loại khử clo của các VK khác nhau cũng rất khác nhau phụ thuộc vào enzyme có mặt trong tế bào, số lượng, loại gene chức năng mã hóa cho enzyme RdhAcó mặt trong genome của mỗi chủng (Waller, 2005). Theo Wagner và đtg, các gene rdhA của chủng D. mccartyi CBDB1-chủng chứa nhiều gene chức năng rdhA nhất được phân thành 4 nhóm chính và được chia thành 13 phân nhóm. Mỗi phân nhóm có từ 1-5 gene rdhA. Mỗi cặp primer được thiết kế cho một phân nhóm (Wagner, 2009).
Các VK KK sử dụng enzyme RdhA xúc tác cho quá trình thay thế các nguyên tử clo bởi hai điện tử từ H2 và một proton (Hiraishi, 2008; Angelo, 2010). RdhA là enzyme chìa khóa tham gia vào chuỗi hô hấp loại khử clo ở các VK KK. Đây là nhóm enzyme có tính đặc hiệu cơ chất rộng, một enzyme có thể xúc tác cho quá trình loại clo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau (Krajmalnik-Brown, 2005). Chẳng hạn, enzyme TceA xúc tác quá trình loại clo của TCE, một số haloalkane và haloalkene (Wagner, 2009). Tuy các VK có khả năng hô hấp loại khử clo có quan hệ phát sinh chủng loại khác xa nhau và thuộc về nhiều chi khác nhau nhưng các gene mã hóa cho enzyme RdhA lại có độ tương đồng rất cao về cấu trúc và chức năng. Các enzyme RdhA của các VK KK đều bao gồm các lớp protein Fe/S có chứa corrinoid (Smidt, 2000).
Chức năng của một số protein được mã hóa từ các gene chức năng của nhóm VK Dehalococcoides đã được chứng minh (Krajmalnik-Brown, 2005). Ví dụ như gene mã hóa cho enzyme PceA xúc tác cho quá trình loại clo từ PCE đến ethene.
Hình 1.9. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự axit amin của các enzyme RdhA (các gene tương ứng có độ tương đồng trên 95%) (Futagami, 2008). Các chủng Dehalococcoides sp.
CBDB1, BAV1, VS, 195 nay là D. mccartyi CBDB1, BAV1, VS, 195(Löffler, 2013)
Mối quan hệ giữa các RdhA ở các VK khác nhau dựa trên trình tự các đoạn axit amin do gene rdhA tương ứng mã hóa (Hình 1.9). Từ mối quan hệ này cho thấy các VK khác nhau có thể mang cùng gene rdhA (gene pceA, cprA) và cấu trúc của các enzyme do chúng mã hóa khá tương đồng với nhau như enzyme PceA của các chủng
Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium hafniense Y51và D. hafniense TCE1. Khi phân tích genome của các chủng VK Dehalococcoides khác, Kube và đtg đã phát hiện mỗi chủng còn chứa một lượng lớn các gene rdhA khác cũng tham gia vào quá trình loại khử clo (Kube, 2005). Chủng D. mccartyi 195 chứa 17 bản sao, chủng D. mccartyi BAV1 chứa 7 bản sao, chủng D. mccartyi FL2 chứa 14 bản sao, D. mccartyi
Việc biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme RdhA tham gia loại khử clo phụ thuộc vào cơ chất chứa clo có mặt trong mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy chính các chất hữu cơ chứa clo là chất cảm ứng của quá trình phiên mã các gene rdhA. Theo Wagner và đtg, 29 trong số 32 gene rdhA của chủng D. mccartyi CBDB1 được sao mã khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường chứa 1,2,3-TrCB và 1,2,4- TrCB. Mức độ phiên mã cao nhất là của gene cbrA - gene mã hóa cho quá trình loại khử clo của chlorobenzene ở chủng CBDB1. Gene này xúc tác quá trình loại khử clo của 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB và từ 1,2,3,4-TCB tới 1,2,4-TrCB. Cũng trong nghiên cứu này, số bản sao của gene cbrA tăng hơn 10 lần so với ban đầu khi nuôi cấy trên hai cơ chất 1,2,3-TrCB và 1,2,4-TrCB. Gene cbdbA80 cũng được phát hiện khi chủng D. mccartyi CBDB1 nuôi cấy trên 2,3-dichlorophenol (Wagner, 2009).
Đối với nhóm VK hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất, ngoài một số ít các VK mang gene rdhA thì còn có rất nhiều gene chức năng khác tham gia vào quá trình hô hấp loại clo. Các gene này có thể là các gene tham gia vào quá trình cắt vòng thơm như benzoyl-CoA, chlorocatechol dioxygenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (Gohil, 2011). Ngoài ra, gene mã hóa cho enzyme 2,4-dichloro- phenoxyacetate/α -ketoglutarate dioxygenase (TfdA) tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D cũng được phát hiện ở một số chủng thuộc chi Pseudomonas (Phùng Khắc Huy Chú, 2012). Các gene mã hóa cho enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase tham gia vào quá trình phân hủy 1,2,3,5- TCB ở chủng Pseudomonas sp. PS14 (Reineke, 2001). Quá trình phân hủy các hợp chất chứa clo đồng trao đổi chất ở các VK hiếu khí còn xuất hiện các gene chức năng như toluene monooxygenase, toluene dioxygenase, phenol monooxygenase and methane monooxygenase. VK Pseudomonas sp. B13 mang các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa benzoate, chlorobenzoate như 3-oxoadipate enol- lactone hydrolase, 3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase, 3-oxoadipyl-CoA thiolase (Kaschabek, 2002). Chủng P. putida KT2440 mang các gene mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy phenylacetate acid như pentylacetyl-CoA ligase, ring- hydroxylating complex, ring-opening enzyme, enoyl-CoA hydratase, acyl-CoA dehydrogenase, putative thioesterase, ketothiolase (Kim, 2009).
Tóm lại, các VK hô hấp loại khử clo cũng như các gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình này ở VK KK rất đa dạng. Các VK này bao gồm nhiều chi thuộc 3 ngành khác nhau là Chloroflexi, Firmicute, Proteobacteria. Các VK hô hấp loại khử clo này có thể nuôi cấy được và không nuôi cấy được phụ thuộc vào các điều kiện trang bị trong phòng thí nghiệm. Cho đến nay còn có rất nhiều hạn chế khách quan và chủ quan trong nuôi cấy VSV nói chung và VSV phân hủy dioxin, các hợp chất hữu cơ chứa halogen nói riêng. Do đó, cần sử dụng nhiều phương pháp tiên tiến khác nhau để có thể đánh giá sự đa dạng các VSV trong đất và trầm tích ô nhiễm. Các phương pháp đó sẽ trình bày dưới đây.