- Mẫu làm giàu trên đất ô nhiễm
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Như đã trình bày ở phần Tổng quan, sự đa dạng về cấu trúc quần xã VSV và đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn được làm sạch từ các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng và Biên Hòa đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết những nghiên cứu đã thực hiện từ trước chủ yếu tập trung vào nhóm VSV hiếu khí như nấm sợi, VK và xạ khuẩn, chỉ một số ít nghiên cứu về VK KK không bắt buộc đã được tiến hành. Trong luận án này, các kết quả sẽ được lần lượt trình bày là:
Đa dạng các VK kỵ khí tham gia hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý: - Đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo nói chung;
- Đa dạng nhóm VK KSF, đa dạng VK Dehalococcoides;
- Đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong mẫu làm giàu;
- Biến động số lượng của VK KK trong các lô xử lý ở sân bay Biên Hòa. Sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào:
- Sự có mặt của gene reductive dehalogenase trong các lô xử lý và mẫu làm giàu; - Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế
bào phát hiện bằng Metagenomics. Đặc điểm sinh học của VK KSF:
- Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng của nhóm VK KK; - Phân lập, phân loại 1 chủng VK KSF đại diện.
Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu. Khả năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất chứa clo:
- Khả năng phân hủy 17 đồng phân dioxin, furan và các hợp chất vòng thơm; - Khả năng phân hủy 2,4,5-T, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK;
- Khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm bởi chủng VK KSF đã làm sạch; Luận án đã sử dụng phương pháp nuôi cấy, làm giàu VK KK truyền thống với nguồn ô nhiễm là chất diệt cỏ và DCĐ là hỗn hợp của dioxin, chất diệt cỏ và các chất trao đổi (metabolites) vẫn còn độc. Một số kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, DGGE, Metagenomics và phương pháp phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) đã được sử dụng để đạt mục tiêu đề ra.
3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý
Như đã trình bày ở mục 1.6, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự đa dạng của các VSV trong đất. Tùy thuộc vào đặc điểm của đối tượng nghiên cứu, phương pháp PCR-DGGE 1, 2 hoặc 3 bước có thể được sử dụng để xác định sự đa dạng của các nhóm VSV trong đất (Dar 2005; Wang 2013). Trong nghiên cứu này, phương pháp nested-PCR hai bước và DGGE được sử dụng để đánh giá sự có mặt của một số nhóm VK có khả năng loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa.
Các mẫu được lựa chọn để nghiên cứu bao gồm 5 mẫu P1, P2, P3, P4, P5 sau xử lý 10 tháng, các mẫu 10DNT và 100DNT lấy vào thời điểm 10 năm sau xử lý, mẫu hồ A và hồ C được thu thập vào cùng thời điểm với mẫu ở các lô xử lý tại Đà Nẵng. Các mẫu M1, M2, M3, M4 tại Biên Hòa sau 18 và 27 tháng xử lý. Kết quả về sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự có mặt của một số VK hô hấp loại khử clo trong các mẫu nghiên cứu
STT Tên mẫu Chi DES Chi DCC Chi DSV Chi DHG Chi DHC Chi DRE Mẫu từ lô xử lý và 2 hồ của sân bay Đà Nẵng
1 P1 + - + - + - 2 P2 + - + - + - 3 P3 + - + - + - 4 P4 + + + - + - 5 P5 + + + - + - 6 Hồ A + - + - + - 7 Hồ C - - + - + - 8 10 DNT + + + - + - 9 100 DNT + + + - + - Mẫu từ lô xử lý của sân bay Biên Hòa
10 M1/2 + + + - + - 11 M2/2 + - + - + - 11 M2/2 + - + - + - 12 M3/2 + - + - + - 13 M4/2 + + + - + - 14 M1/4 + + + - + - 15 M2/4 + - + - + - 16 M3/4 + - + - + - 17 M4/4 + + + - + - Chú thích: +: có mặt VK, -: không có mặt VK, Mx/2: mẫu đất ở lô xử lý thứ x ở lần lấy mẫu thứ 2 (18
tháng); Mx/4: mẫu đất ở lô xử lý thứ x ở lần lấy mẫu thứ 4 (27 tháng); Chi DES: cặp mồi DES436f/DES1027r đặc hiệu cho nhóm Desulfitobacterium; Chi DSV: cặp mồi DSV230f/DSV838r đặc hiệu cho chi Desulfovibrio, Desulfomicrobium; Chi DCC: cặp mồi DCC305f/DCC1165r đặc hiệu cho chi Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema, Chi DHG: Cặp mồi BL-DC142f/BL-DC1243r đặc hiệu cho chi Dehalogenimonas, Chi DHC: cặp mồi DHC730f/DHC1350r hay DHC774f/DHC1212r
đặc hiệu cho chi Dehalococcoides, Chi DRE: cặp mồi DRE445f/DRE1248r đặc hiệu cho chi
Dehalobacter
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có mặt nhiều nhóm VK KK có khả năng loại khử clo. Hai chi VK Dehalococcoides và
Desulfitobacterium được nhiều nghiên cứu chứng minh chúng tham gia vào quá trình loại khử clo của các hợp chất vòng thơm. Các đại diện của hai chi trên đều có mặt trong các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa. Một số nhóm VK KSF khác như
Desulfovibrio, Desulfomicrobium từ các lô xử lý cũng đã được phát hiện có mặt ở tất cả các mẫu đất của Đà Nẵng và ở cả hai đợt lấy mẫu của Biên Hòa chứng tỏ VK nhóm này có mật độ cao. Các chi Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema chỉ được phát hiện trong lô số 1, số 4 của cả hai đợt lấy mẫu ở Biên Hòa và trong mẫu P4, P5, 10DNT, 100DNT ở Đà Nẵng.
3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý
Như đã trình bày ở trên, nhiều VK có khả năng hô hấp loại khử clo đã được phát hiện bằng các cặp mồi đặc hiệu trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, trong đó có một số chi thuộc nhóm VK KSF. Do đó, sự đa dạng của VK KSF đã được nghiên cứu kỹ và chi tiết hơn bằng phương pháp DGGE với cặp mồi DCC305f kẹp đoạn GC và DSV838r đặc hiệu tương ứng cho các chi
Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema và Desulfovibrio, Desulfomicrobium.
Mẫu 10DNT, 100DNT sau xử lý 10 năm, 5 mẫu P1, P2, P3, P4, P5 sau xử lý 10 tháng tại sân bay Đà Nẵng và 4 mẫu M1, M2, M3, M4 được thu thập vào thời điểm 18 tháng sau xử lý tại Biên Hòa đã được lựa chọn cho nghiên cứu đa dạng VK KSF. Kết quả về sự đa dạng VK KSF từ các lô xử lý phân tích bằng kỹ thuật DGGE được trình bày ở Hình 3.1.
Nhìn chung, VK KSF phát hiện được bằng DGGE ở Đà Nẵng đa dạng hơn so với Biên Hòa. Trên điện di đồ cho thấy có từ 7-13 băng DNA trên mỗi lô xử lý ở Đà Nẵng (Hình 3.1A). Số lượng các băng DNA của VK KSF ở Biên Hòa ít hơn, từ 5-7 băng và các băng thu được không nét (Hình 3.1B). Từ kết quả phân tích DGGE, các băng đậm nét và đặc trưng cho các mẫu được lựa chọn để xác định trình tự. Cây phát
sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA cho thấy các VK KSF ở Biên Hòa và Đà Nẵng có quan hệ gần với các chi Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfosarcinar, Desulfobacterium (Hình 3.2).
A
B
Hình 3.1. Điện di đồ DGGE với cặp mồi DCC305f/DSV838r đặc hiệu cho VK KSF từ các mẫu ở lô xử lý tại Đà Nẵng (A) và Biên Hòa (B)
Chú thích: P1, P2, P3, P4, P5: Các mẫu đất ở lô xử lý 2 m3 sau 10 tháng; 10DNT, 100DNT: các mẫu đất ở lô xử lý 10 m3 và 100 m3 sau 10 năm; M1, M2, M3, M4: các mẫu đất ở lô xử lý 3.384 m3
sau 18 tháng xử lý; Marker: 1kb.
Tất cả các dòng VK KSF lựa chọn đã được đăng ký trên GenBank với mã số như đã trình bày trên Bảng 3.2. Số liệu ở Bảng 3.2 thể hiện mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF trong các lô xử lý so với các dòng VK gần gũi.
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của VK KSF trong các lô xử lý. Thanh bar thể hiện sự sai khác giữa các nucleotide (2/100 nucleotide)
Bảng 3.2. Mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF tại các lô xử lý và một số VK gần gũi
STT Địa
điểm Dòng
Mã số trên
GenBank Vi khuẩn/dòng gần gũi
% tương đồng 1 B iê n Hò