15 DET0318 200 bp DET0318 484F
2.2.6.Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate
Các mẫu đất đã lựa chọn (Bảng 2.1) được làm giàu trên môi trường Posgate B chứa 3,2% DCĐ, 10% giống. Các mẫu làm giàu được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, kỵ khí - tối, ở 28-30oC trong thời gian 1 tháng. Quần xã VK KSF có khả năng phân hủy
dioxin thu được sau ba lần làm giàu liên tiếp được sử dụng làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo
A, Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên 2,4-DCP, 2,4,5-T
Các mẫu đất đã lựa chọn (Bảng 2.1) được làm giàu trên môi trường khoáng kỵ khí M204 có bổ sung các chất cho điện tử (pyruvate, formate, acetate, fumarate với nồng độ mỗi chất là 5 mM) và chất nhận điện tử. Các chất nhận điện tử như 2,4,5-T và 2,4-DCP (với nồng độ cuối cùng trong môi trường là 100 ppm) và DCĐ (2% v/v) được bổ sung vào bình làm giàu, làm bay hơi hết dung môi bằng khí N2 vô trùng. Sau đó, đất từ các lô xử lý được bổ sung với nồng độ 30% (w/v) vào bình nuôi dưới dòng khí N2. Cuối cùng, môi trường M204 được bổ sung vào bình nuôi trong điều kiện kỵ khí dưới dòng khí nitơ vô trùng. Đậy kín bằng nút cao su và nút nhôm để đảm bảo kỵ khí. Nuôi cấy tĩnh, kỵ khí, tối ở 28-30°C trong 2 tháng.
Sau 3 lần làm giàu liên tiếp, mỗi mẫu được lấy ra 1,5 ml ở các khoảng thời gian khác nhau (9-12 tuần). Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, phần dịch được dùng để xác định khả năng phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất chứa clo. Phần sinh khối được sử dụng để tách DNA tổng số phục vụ cho các nghiên cứu xác định sự có mặt của VK KK hô hấp loại khử clo.
B, Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin chứa hỗn hợp chất diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5- T), các sản phẩm phân hủy chất diệt cỏ (2,4-DCP, 2,4,5-TCP), PCDDD/Fs và đặc biệt chứa 2,3,7,8-TCDD đến 99% tổng độ độc được sử dụng làm nguồn ô nhiễm, chất nhận điện tử của các VK KK hô hấp loại khử clo. Đất được sấy ở 105oC đến khô hoàn toàn, nghiền và rây để loại bỏ các hạt to, tạp chất, trộn đều để đồng nhất. Đất được bổ sung vào môi trường khoáng M204 với tỷ lệ 10% (w/v). Quần xã VSV từ các mẫu đất ở 4 ngăn của lô xử lý tại sân bay Biên Hòa được lấy và trộn đều dưới dòng khí N2 vô trùng ở tất cả các điểm lấy mẫu sau 36 tháng xử lý. Quần xã VK từ lô xử lý được bổ sung bằng cách thêm 32 g đất bùn từ lô xử lý sinh học quy mô 3.384 m3 tại sân bay Biên Hòa (2 g đất/vị trí lấy mẫu). Quần xã này được làm giàu ở thể
tích 500 ml trên môi trường khoáng kỵ khí M204 có bổ sung đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc khoảng 41.000 pg TEQ/g đất khô. Mẫu đối chứng chứa môi trường M204 có bổ sung đất ô nhiễm. Nuôi cấy VK KK trong điều kiện tĩnh, kỵ khí, tối trong thời gian 1 năm. Lấy mẫu thu sinh khối VSV để tách DNA theo hướng dẫn của PowersoilTM DNA Isolation Kit (MoBio) và xác định sự có mặt của các VK KK bằng phương pháp được trình bày ở mục 2.2.12. Phần bùn đất được sử dụng để phân tích các đồng phân dioxin và các sản phẩm phân hủy sinh học của chất diệt cỏ theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.11.