- Mẫu làm giàu trên đất ô nhiễm
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN
Như phần Kết quả nghiên cứu đã trình bày, VK KK hô hấp loại khử clo và các gene tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo rất đa dạng. Tuy nhiên, với mỗi phương pháp nghiên cứu khác nhau thì kết quả nhận được về sự đa dạng VK KK không giống nhau. Để thấy rõ sự khác nhau đó, phần Bàn luận sẽ được trình bày lần lượt như sau:
Sự đa dạng các VK KK
Sự đa dạng các gene chức năng Đặc điểm sinh học của VK KSF
Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
Khả năng chuyển hóa và phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin. Sự đa dạng các VK KK
Trong nghiên cứu này, khi sử dụng phương pháp nested-PCR để đánh giá sự đa dạng các VK KK trong các lô xử lý phát hiện được các chi Desulfitobacterium, Dehalococcoides và nhóm Desulfovibrio-Desulfomicrobium, Desulfococcus- Desulfosarcinar- Desulfonema. Phương pháp nested-PCR chưa phát hiện được các VK KK thuộc chi Dehalogenimonas, Dehalobacter. Đây là hai chi VK đã được chứng minh khả năng loại khử clo rất nhiều hợp chất vòng thơm và mạch thẳng chứa clo (Boyle, 1999; Drzyzga, 2001; Grostern, 2006; Bunge, 2009; Moe, 2009; Yan, 2009; Maphosa, 2010, 2012; Duret, 2012; Löffler, 2013). Kết quả nhận được có thể giả định rằng hai chi Dehalogenimonas và Dehalobacter không tồn tại hay số lượng của chúng không đủ lớn cho nên phương pháp nested-PCR chưa phát hiện được trong các mẫu đất ở các lô xử lý.
Các kết quả về đa dạng VK KK loại khử clo trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng sự có mặt của Dehalococcoides và một số VK KSF như Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomicrobium,Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema có vai trò trong quá trình chuyển hóa chất diệt cỏ, các đồng phân của dioxin chứa nhiều clo đến các đồng phân chứa ít clo hơn. Quá trình này giúp cho các VSV hiếu khí
tiếp tục cắt vòng, loại clo và cuối cùng là khoáng hóa hoàn toàn các chất độc trong các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa. Dehalococcoides đã được chứng minh là nhóm loại khử clo rất tiềm năng bao gồm cả dioxin (Adrian, 2007; Bunge, 2003, 2008; Hendrickson, 2002; Hiraishi, 2005a,b 2008; Liu, 2014b; Yoshida, 2005). Tuy nhiên, nhóm vi khuẩn này có kích thước rất nhỏ, có kiểu trao đổi chất trong điều kiện sống rất giới hạn, phụ thuộc vào nguồn cung cấp H2 có vai trò là chất cho điện tử trong quá trình hô hấp clo từ các nhóm vi khuẩn khác. Hơn nữa, chúng còn là vi khuẩn loại khử clo bắt buộc trong điều kiện kỵ khí vô cùng nghiêm ngặt nên rất khó nuôi cấy (Loffer, 2013). Mặc dù đã được gọi là thợ khử clo nhưng vai trò thực sự trong quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong các lô xử lý mà đề tài thực hiện thì thợ khử clo chưa chắc thuộc về Dehalococcoides. Tuy không có mặt ở hầu hết các vị trí trong lô xử lý nhưng sự có mặt của Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema cùng với việc chiếm ưu thế của các VK KSF khác như
Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomicrobium đã minh chứng cho vai trò của nhóm VK KSF trong quá trình chuyển hóa và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin.
Theo nhiều nghiên cứu, VK KSF có mặt ở hầu hết các môi trường sinh thái như trong nước biển, nước ngọt và cả trầm tích, đất, đặc biệt là những nơi có nồng độ sulfate cao. Đồng thời, các VK KSF có khả năng hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Barton, 2007) và sử dụng H2, các hợp chất hữu cơ như acetate, formate, lactate v.v. làm nguồn carbon và chất cho điện tử trong quá trình sinh trưởng (Holliger, 1994). Vi khuẩn KSF rất đa dạng và phần lớn trong số chúng đã được chứng minh có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp loại clo (Boyle, 1995; Reineke, 2001; Muyzer, 2008; Angelo, 2010). Trong nghiên cứu này, chủng VK KSF BDN10T được phân lập và làm sạch từ lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Đà Nẵng đã loại bỏ được 85-86% các hợp chất 2,4,5-TCP và 2,4-DCP. Theo Nguyễn Thị Sánh (2007), quần xã VK KSF SETDN20 có khả năng loại bỏ 17,9% tổng độ độc trong 60 ngày trong đó đồng phân 2,3,7,8-TCDD giảm từ 4.299 ng TEQ/kg đất khô xuống còn 3.528 ng TEQ/kg đất khô. Nhóm VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa có sự đa dạng khá cao và chiếm ưu thế hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Các kết quả
thu được cho thấy nhóm VK KSF có thể đã góp phần đáng kể làm tổng độ độc trung bình của các lô xử lý giảm. Cụ thể là ở 4 lô xử lý bằng phân hủy sinh học tại Biên Hòa, tổng độ độc từ khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất khô đã giảm xuống còn 52 ng TEQ/kg đất sau 27 tháng (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Tuy nhiên, để khẳng định mức độ tham gia của nhóm VK KSF trong quá trình phân hủy hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện in situ trong các lô chôn lấp tích cực ở Đà Nẵng và Biên Hòa cần thêm rất nhiều nghiên cứu cơ bản về sinh học kết hợp với phân tích hóa học ở mức độ cao.
Khi sử dụng phương pháp DGGE để xác định sự đa dạng VK KSF trong các lô xử lý cho thấy tại Đà Nẵng xuất hiện 4 chi Desulfosarcinar, Desulfococcus, Desulfovibrio và Desulfobacterium còn tại Biên Hòa chỉ xuất hiện 3 trong 4 chi được đề cập ở trên (Hình 3.1). Các dữ liệu thu được chứng tỏ sự đa dạng của VK KSF không cao trong cả 4 lô xử lý (khối lượng 846 m3/lô) của toàn bộ khu vực nghiên cứu ở Biên Hòa khi sử dụng phương pháp xử lý, điều kiện sinh thái gần như nhau. Chính vì vậy, sự đa dạng VK KSF ở các lô xử lý này khá giống nhau. Khác với các lô xử lý ở Biên Hòa, VK KSF ở các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng có sự đa dạng hơn. Sự khác biệt quan trọng nhất giữa các mẫu nghiên cứu là ở Biên Hòa có cùng thời gian và phương thức xử lý, còn ở Đà Nẵng có quy trình xử lý và thời gian xử lý hoàn toàn khác nhau.
Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng VK KSF SRBDNP2.5 ở lô xử lý P2 của Đà Nẵng tương đồng 99% với dòng VK không nuôi cấy ACS48 và chủng
Desulfovibrio sp. PA35E4 (Hình 3.2). Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng VK SRBDNP5 tương đồng 98% với chủng Desulfovibrio sp. GY2 có khả năng loại clo của penta-, tetra-brominated biphenylether, polychlorinated biphenyl và cũng tương đồng 98% với dòng SB20 đã được chứng minh có khả năng phân hủy n-alkane (Lee, 2013).
Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng SRBBH2 và SRBBH3 tương đồng 99% với chủng Desulfovibrio sp. BBH1.3 phân lập và nuôi cấy được từ mẫu của Biên Hòa, chủng Desulfovibrio sp. BDN100T phân lập từ lô xử lý của Đà Nẵng (Hình 3.2). Một
số dòng VK từ các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa không chỉ có sự tương đồng với nhau (99%) mà còn tương đồng cao với các đại diện thuộc chi Desulfovibrio. Khả năng chúng không phải cùng loài cũng đã được thể hiện trên cây phân loại.
Các trình tự đoạn gene 16S rRNA của các dòng SRBDN10DNT và SRBBH1 có quan hệ gần gũi với nhau và tương đồng 99% với trình tự đoạn gene 16S rRNA của một số loài thuộc chi Desulfococcus (Bảng 3.2) như D. multivorans DSM 2059,
D. biacutus DSM 5651 và chủng Desulfococcus sp. DSM8541. Kết quả thu được từ phân tích trình tự đoạn gene 16S rRNA của một số dòng VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa cho thấy các dòng này có quan hệ gần gũi với các dòng VK
Desulfococcus, Desulfovibrio và Desulfobacterium. Một số đại diện của các chi kể trên đã được công bố là có khả năng hô hấp loại khử clo (Boyle, 1995, 1999b; Sun, 2000; Haggbloom, 2006).
Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các dòng VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa (Hình 3.2) cho thấy chúng có quan hệ xa với các nhóm loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalobacter, Desulfitobacterium,
Clostridium. Đặc biệt, giữa các dòng VK KSF phát hiện được ở Đà Nẵng và Biên Hòa có sự tương đồng đến 99% như các dòng SRBDNP4, SRBDNP3, SRBDN10DNT thuộc Đà Nẵng tương đồng với dòng SRBBH1 thuộc Biên Hòa. Hai dòng SRBBH3, SRBBH2 của Biên Hòa tương đồng 99% với dòng SRBDN100DNT ở Đà Nẵng. Kết quả thu được cho thấy VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa cùng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin với điều kiện sinh thái không hoàn toàn giống nhau nhưng VK thuộc nhóm này vẫn có sự tương đồng cao. Kết quả thu được chứng tỏ nhóm này phân bố rộng, số lượng lớn ở các lô xử lý tại Biên Hòa và Đà Nẵng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình loại khử clo các hợp chất vòng thơm trong đó có dioxin.
Đối với chi Dehalococcoides, trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA của các dòng VK Dehalococcoides tại lô xử lý P5 và mẫu 1.2 tương đồng trên 98% với các chủng D. mccartyi 195, CBDB1, BAV1, MB, FL2 (Hình 3.4) chứng tỏ chúng tương đối giống với các chủng này. Tất cả các chủng Dehalococcoides trên đều biết đến với khả năng loại khử clo của PCE, TCE cũng như các hợp chất hữu cơ vòng thơm,
đa vòng thơm chứa nhiều clo như polychlorobenzene, polychlorophenol, 1,2,3,4- TCDD như đã trình bày ở phần Tổng quan (Bunge, 2003; Löffler, 2013). Một số dòng như BDNHC band 1 từ mẫu hồ C ở Đà Nẵng, BBH1.1 băng 2, BBH1.1 băng 3 ở lô số 1 vị trí 1 chỉ tương đồng trên 90% - 96% với các chủng đã đề cập ở trên. Từ kết quả thu được có thể giả thiết rằng Dehalococcoides trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam có sự khác biệt so với các chủng đã công bố trên thế giới. Những khác biệt giữa các VK Dehalococcoides có thể được thể hiện ở số bản sao gene chức năng rdhA tham gia quá trình loại khử clo. Trong nghiên cứu này, các gene
rdhA giống với các gene đã được công bố trên thế giới chưa được phát hiện có thể do bản chất ô nhiễm tại Việt Nam hoàn toàn không giống với các chất ô nhiễm mà các chủng Dehalococcoides đã được phân lập ở các châu lục khác. Các hợp chất chứa clo được sử dụng trong nghiên cứu này là hỗn hợp của 2,3,7,8-TCDD, các chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và các chất trao đổi khác. Đây là những hợp chất chưa được sử dụng ở bất kỳ nghiên cứu nào trong các công bố quốc tế. Do đó, khi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho gene rdhA đã được các công trình nghiên cứu đăng tải để xác định sự có mặt của chúng trong các lô xử lý của Việt Nam đã không thu được kết quả. Khả năng cao nhất là do chúng không đặc hiệu đối với gene rdhA của Dehalococcoides trong các lô xử lý. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với những minh chứng cho rằng các chủng Dehalococcoides khác nhau là do khả năng sử dụng các hợp chất chứa clo với các cấu trúc hóa học khác nhau (Löffler, 2013).
Vì VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và thuộc cả 3 nhóm như đã trình bày ở phần Tổng quan. Tuy nhiên, đất ô nhiễm của Việt Nam chứa rất nhiều hợp chất dioxin/furan khác nhau trong đó có các đồng phân độc nhất như 2,3,7,8-TCDD, 1,2,3,7,8-PeCDD và nhiều hợp chất chứa clo vòng thơm khác. Vậy, nhóm VK KK nào mới thực sự đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phân hủy và chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn là một ẩn số. Với các phương pháp nghiên cứu đa dạng VK KK ở trên đã trình bày vẫn còn nhiều hạn chế nên bức tranh về sự đa dạng VSV cần phải tiếp tục nghiên cứu bằng các công cụ tiên tiến và thực hiện trên nhiều mẫu nghiên cứu hơn. Do đó, phương pháp xác định sự phân bố và
đa dạng các quá trình trao đổi chất của VSV bằng công cụ hiện đại nhất cho đến thời điểm này là Metagenomics đã được thực hiện. Đây là một kết quả hết sức quan trọng mà luận án đã thu được. Sau khi nhận được kết quả về hiệu suất khử độc dioxin của quần xã VK KK từ lô xử lý ở Biên Hòa (sau 36 tháng) ở mẫu làm giàu 1 năm với độ độc gấp 4 lần mẫu hiện trường ban đầu, nghiên cứu đã được đã tiến hành giải trình tự và phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng cho Metagenomics. Số liệu thu được cho thấy quần xã VK tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin vô cùng phong phú. Nhìn vào sự phân bố của các VK và các gene chức năng trong mẫu làm giàu thì không phải Dehalococcoides và các gene
rdhA đóng vai trò quan trọng nhất như các nhà khoa học đã dự đoán mà quần xã VK khác mới thực sự đóng vai trò chính và sự đa dạng của các gene khác mới làm nên quá trình khử độc thành công.
Trong metagenome của mẫu làm giàu có 4 ngành VK KK với các đại diện thuộc 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo, đó là nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalogenimonas; nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc như Desulfovibrio, Desulfococcus, Geobacter v.v.; nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất bao gồm Pseudomonas, Bacteroides, Shewanella, Clostridiumv.v. (Bảng 3.7). Đây là kết quả rất thú vị vì có nhiều nhà khoa học cho rằng chỉ một vài loài VK đã có thể làm sạch được dioxin và các chất tương tự. Ngoài các nhóm VK loại khử clo đã được chứng minh là có mặt trong lô xử lý, các VK khác có khả năng chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo ở các mức độ khác nhau cũng đã được phát hiện. Với các VK này đã được thông báo là có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm (Reineke, 2001). Đây là các VK thuộc nhóm VK hiếu khí (Burkholderia, Xanthomonas, Achromobacter v.v.), kỵ khí bắt buộc (Bacteroides, Anaerolinea, Pelobacter, Parabacteroides v.v.) hay tùy tiện (Azoarcus, Aeromonas, Desulfotomaculum, Aromatoleum, Campylobacter v.v.). Hầu hết các VK này đã được chứng minh có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm cũng như các hợp chất hữu cơ chứa clo (Reineke, 2001). Sự góp mặt của từng VK trong số này tuy không nhiều nhưng số lượng của tất cả các
chi cộng lại lại chiếm tỷ lệ tương đối cao trong metagenome. Điều đáng chú ý là các chi VK trên chủ yếu thuộc nhóm kỵ khí tùy tiện. Cùng với phân tích bằng nested- PCR và DGGE, các kết quả thu được từ metagenome của mẫu làm giàu đã phản ánh được sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí loại khử clo cũng như các nhóm vi khuẩn khác tham gia trong quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả vòng thơm) có và không chứa clo. Tuy nhiên, những dữ liệu thu được bằng công cụ Metagenomics đã cho ta thấy một bức tranh toàn diện hơn về quần xã vi khuẩn sinh trưởng trên nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Những kết quả này một lần nữa khẳng định vai trò của các nhóm vi khuẩn, đặc biệt là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy tiện trong quá trình chuyển hóa chất diệt cỏ, dioxin và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong lô xử lý ở sân bay Biên Hòa.
Một điều rất bất ngờ và thú vị về sự đóng góp của các vi khuẩn trong mẫu làm giàu là sự chiếm ưu thế của chi Pseudomonas với tỷ lệ cao nhất (59,77%). Theo một số nghiên cứu đã công bố về sự đa dạng VSV tại các lô xử lý được phân tích bằng DGGE, SSCP cũng cho thấy chi Pseudomonas chiếm đa số trong lô xử lý ở các quy mô khác nhau tại Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu, 2007b, 2007c, 2008, 2009). Do đó, kết quả thu được của các nghiên cứu trước đây và cả trong nghiên cứu này chứng tỏ VK
Pseudomonas luôn có mặt và có thể có vai trò rất quan trọng đối với quá trình phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo trong các lô xử lý. Pseudomonas (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
là VK hiếu khí nhưng có khả năng sinh trưởng trong điều kiện có rất ít hay hoàn toàn không có oxy (Reineke, 2001, Nguyễn Thị Sánh, 2005). Chúng có thể loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất hoặc chuyển hóa và phân hủy hợp chất hữu cơ chứa clo theo các cơ chế khác (Hiraishi 2008; Reineke, 2001). Do đó, Pseudomonas