15 DET0318 200 bp DET0318 484F
2.1.5.Thành phần môi trường nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng
2.1.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường Posgate B được sử dụng để làm giàu và phân lập VK KSF (Postgate, 1984). Thành phần môi trường (g/l): KH2PO4 0,5, NH4Cl 1, MgSO4 1, CaSO4 1, NaCl 1, Na-lactate 2,75, H2O 1000 ml, pH 6,5-7. Môi trường được bổ sung 10 ml FeSO4 1%, dung dịch NaHCO3 5% để chỉnh pH, Na2S 10% đến xám nhạt. Các dung dịch vitamin I, vi lượng I, vitamin C mỗi loại 1 ml/l.
Môi trường SH1 được sử dụng để nuôi cấy VK KK phân hủy dioxin (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Thành phần môi trường (g/l): KH2PO4 0,5, CaSO4 1, NH4Cl 1, MgSO4 2, NaCl 1, K2HPO4 0,5, NH4NO3 1, natri acetate 1, natri lactate 1, H2O 1000 ml. Các acid hữu cơ được bổ sung gồm butyric acid 10 l, propionic acid 10 l, isobutyric 1 l, succinic acid 3,5 l. Các chất bổ sung bao gồm 10 ml FeSO4 1%, dung dịch NaHCO3 5% để chỉnh pH, Na2S 10% đến xám nhạt. Các dung dịch vitamin I, vi lượng I, vitamin C, cao men 10% mỗi loại 1 ml/l.
Môi trường khoáng kỵ khí M204 được dùng để làm giàu một số VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo (Ewald, 2007). Thành phần bao gồm (g/l): MgSO4.7H2O 0,069, MgCl2.6H2O 0,053, CaCl2.2H2O 0,12, NH4HCO30,42, cao nấm men 0,05, H2O 1000, 1 ml/l dung dịch vi lượng I, rasazurin 0,1%. Môi trường được đun sôi và làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitơ. Điều chỉnh pH 7-7,2 bằng NaHCO3 tinh thể dưới dòng khí N2 để đảm bảo môi trường kỵ khí. Khử trùng môi trường ở 121oC, 20 phút. Trước khi bổ sung môi trường vào các mẫu nuôi cấy, bổ sung thêm nguồn carbon (bao gồm pyruvate, formate, furmarate, lactate với nồng độ 5 mM), 1 ml/l vitamin II, Na2S, NaHCO3 (điều chỉnh lại pH), Ti-(III)-citrate, FeS
0,15 mM. Các chất hữu cơ chứa clo được sử dụng làm chất nhận điện tử như 2,4- DCP, 2,4,5-T (nồng độ 100 ppm) và DCĐ (2% v/v) để làm giàu VK KK hô hấp loại clo bao gồm cả Dehalococcoides (Ewald, 2007).
2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng
Dung dịch vi lượng I (mg/l): nitrilotriethanol 12800, FeCl2.4H2O 2, ZnCl2 70, MnCl2.2H2O 80, H3BO3 6, CoCl2.6H2O 190, CuCl2.2H2O 2, NiCl2.6H2O 24, Na2MoO4.2H2O 36, H2O 1000 ml, NaOH bổ sung đến pH 6,0. Dung dịch vitamin I
(mg/l): Biotin 1, p-aminobenzoic acid 5, vitamin B12 5, thiaminechloride 10, H2O 1000 ml. Dung dịch vitamin II (mg/l): L-liponic acid 5, D(+)-biotin 2, nicotinic acid 5, Ca-D(+)-pantothenate 5, pyridoxinhydrochloride 10, thiaminechloridechloride 5, folic acid 2, riboflavin 5, cyanocobalamine 50, p-aminobenzoic acid 5, H2O 1000 ml.
Dung dịch Sol I: Tris HCl 1M, pH8 1,25 ml; EDTA 0,5M 1 ml; glucose 1M 2,5 ml, H2O 45,25 ml. Khử trùng và bảo quản ở 4oC. Dung dịch Sol II: NaOH 10 N 20l; SDS 20% 50 l; dH2O 930 l. Pha ngay khi sử dụng, ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Sol III: CH3COOK 14,7 g; CH3COOH glacial 5,75 ml; H2O đến 50 ml, pH 5,2. Khử trùng và bảo quản ở 4oC. Các dung dịch Sol I, II, III được sử dụng để tách dòng VK và plasmid.
Lysis buffer Tris HCl 1M, pH8 300 l; SDS 20% 15 l; EDTA 0,5M pH8 600 l; NaCl 5M l; H2O 27,3 ml. TAE 50x Tris base 242 g; CH3COOH glacial 57,1 ml; EDTA 0,5M, pH8 100 ml; H2O đến 1000 ml. Dung dịch lysis bufer được sử dụng để tách DNA tổng số theo phương pháp sử dụng chloroform. Dung dịch TAE được sử dụng để điện di sản phẩm PCR và DGGE.