Ứng dụng enzyme trong kỹ thuật di truyền

b) Cơ chế tác động của enzyme pectinase

3.3.6 Ứng dụng enzyme trong kỹ thuật di truyền

3.3.6.1. Enzyme cắt hạn chế (restrition endonuclease)

Các enzyme cắt hạn chế là những enzyme cắt phía trong phân tử DNA thành những đoạn đặc hiệu. Lần đầu tiên vào 1950, các nhà khoa học phát hiện ra một loại enzyme có mặt trong vi khuẩn có khả năng ngăn cản sự phát triển của thực khuẩn thực thể. Các enzyme này cắt DNA của thực khuẩn thể làm chúng không phát triển được trong tế bào chủ. Người ta tách tế bào này ra khỏi tế bào chủ và thực hiện những phản ứng enzyme trong ống nghiệm, các enzyme này không chỉ cắt DNA lạ mà cắt DNA của chính tế bào chủ.

Các enzyme cắt giới hạn được đặt tên theo tên của vi khuẩn mà ta dùng để thu nhận giới hạn. Ví dụ:

Eco RI: enzyme cắt giới hạn của E.coli

Bam HI: enzyme cắt hạn chế của Bacillus amylolique. Trong đó: - Chữ đầu chỉ loại

- Hai chữ sau chỉ loài

- Chữ số la mã I, II,…chỉ sự tách đầu tiên và thứ hai…

Enzyme cắt hạn chế đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích genome. Chúng có khả năng ghi nhận các trình tự (sequence) đặc biệt của nucleotide và tham gia cắt ở vị trí đặc biệt trong DNA. Đây là enzym bắt buộc ở trong những thao tác đầu tiên của tiến trình tái tổ hợp DNA. Enzyme này được miêu tả gồm hai phần:

- Phần đầu có tính giới hạn (restriction), viết tắt là R - PhẦn sau có tính cải biến (modification), viết tắt là M

Chính hệ thống R-M này giúp vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của thục khuẩn thể hoặc những nhân tố di truyền lạ khác.

Hệ thống R-M tồn tại rất đa dạng không chỉ ở các loài VSV khác nhau mà ngay cả trong một loài VSV. Hiện nay, người ta đã tìm thấy khoảng 2100 type III có tính đặc hiệu rất cao, 190 nhóm DNA modification methyltransferase đang được nghiên cứu và ứng dụng.

Hệ thống R-M có hai tác động đặc hiệu :

• Restriction endonuclease (viết tắt là R-Enase) tác động lên một vị trí nhất định. Ngoài ra chúng có tác động phá hủy DNA lạ.

Modification

3.3.6.2. Xác định vị trí trong các chuỗi enzyme :

Trong kỹ thuật di truyền, người ta thường dùng nhóm từ recognition sequence, có nghĩa là chuỗi ( trình tự, dỹ) mã xác định. Các enzyme cắt có tính chất đặc hiệu cao với trình tự nucleotit trong DNA. Các enzyme sẽ cắt đúng vị trí mà chúng tìm thấy.

Vị trí này được gọi là “targt site” khi đó, DNA sẽ được cắt ra từ đoạn ngắn hoặc dài khác nhau. Trong các type của enzyme cắt giới hạn, type được người ta chú ý nhiều nhất. Chúng có chuổi mã xác định theo kiểu tetra, penta và hexa nucleotit. Những trình tự như vậy sẽ được viết từ trái sang phải thepo hướng 5’-3’(palindromic). Ví dụ: 5’-GAATTC-3’. Trình tự xác định hướng có trục đối xứng theo vòng kín (rotational). Ví dụ, trình tự mã xác định của EcoRI là: 5’-GAATTC-3’, 3’-CTTAAG-5’

Về mặt lý thuyết, có 16 tetranucleotide đối xứng với 64 hexanucleotide. Trong đó, chỉ có 50% thực sự hoạt động tại các Targetsite của nó.

enzyme cắt giới hạn các chuỗi DNA theo một số kiểu sau: - Cắt theo kiểu blunt end ( dạng hai đầu so với dây đôi).

- Cắt theo kiểu sticky end hay cohesive, đoạn cuối dây đôi so le tại vị trí 5’. - Cắt theo kiểu sticky end, tại vị trí 3’.

Các enzyme tham gia phân cắt theo ba kiểu này được trình bày ở bảng 3.5

5’-end 3’-end Blunt end

Enzyme Trình tự

nucleotide Enzyme Trình tự nucleotide enzyme Trình tự nucleotide Taq I T/CGA Pst I CTGCA/G Alu I AG/CT

Cla I AT/CGAT Scac I GAGCT/C Fnul II CG/CG Mbo I /GATC Sph I GCATG/C Dpn I GA/TC Bgl I A/GATCT Bde I GGCGC/C Hae III GG/CC BamHI G/GATCC Apa I GGGCCC/C Pvu II CAG/CT Bcl I T/GATCA Kpn I GGTAC/C Sma I CCC/GGG Hind III A/AGCTT Nae I GCC/GGC

Nco I C/CATG Hpa I GTT/AAC

Xma I C/CCGG Nru I TCG/CGA

Xho I C/TCGAG Bal I TGG/CCA

ecoRI G/AATTC Mst I TGC/GCA

Sal I G/TCGAC Aha III TTT/AAA Xbal I T/CTAGA EcoRV GAT/ATC

3.3.6.3Tính chất đặc biệt của chuỗi mã xác định.

Số lượng enzyme thuộc type II cần thiết để thực hiện phản ứng phân cắt DNA phụ thuộc vào chiều dài của DNA, hợp phần các base có trong DNA, tỷ lệ GC trong toàn bộ base của DNA.

Các loại enzyme chứa chuỗi mã xác định thuộc dạng hecxa nucleotide có đũ bốn loại base thường chứa nhiều hơn một vị trí xác định (recognition site) trong phân tử DNA. Ví dụ: Sma I vị trí xác định chỉ bao gồm C và G (CCC/GGG) hoặc Xma III(C/GGCC).

Hiện tượng này sẽ không có trong phân tử nhỏ hơn PBR 322 và SV40. hiện tượng này được gọi là tính đặc hiệu của chuỗi mã xác định.

Bảng trên cho thấy enzyme FnuDII (CG/CG) cắt plasmil PBR 322 khoảng 23 lần. FnuDII không cắt SV40. Ở bản trên cũng cho thấy PBR 322 và SV40 đều bị cắt cùng một tần suất tương tự bởi HaeIII (GG/CC). Chuỗi mã xác định này không chứa CpG dinucleotide. Các sinh vật eukariotic không chứa chuỗi mã dinucleotide.

3.3.6.4.Phương pháp phát hiện và tinh sạch restriction endonuclease

DNA rất dể quan sát dưới tia cực tím nhờ DNA có tính hình quang khi nhuộm với ethidium bromide. Tia sáng có bước sống 254 nm có độ cảm cao nhất. Người ta có thể phục hồi DNA trên gen trong bước sống của tia sáng 366nm. Sự chuyển động của các đoạn DNA trên agarose và polyacry lamide gen tương ứng với logarithm trọng lượng phân tử của DNA

Để sử dụng enzyme các giới hạn, người ta trộn lượng enzyme cắt giới hạn với DNA trong dung dịch điệm ở 370C. hoạt tính của enzyme được đo bằng đơn vị tương đương lượng enzyme cần thiết để cắt 1 microgam DNA trong 1 giờ ở 370C.