Chơng 2 vật liệu và phơng pháp 2.1vật liệu và hoá chất, thiết bị máy móc
2.2.6 Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế
Enzym hạn chế là nucleaza nội bào có khả năng nhận biết các đoạn ADN với các trình tự nucleotit nhất định, bám vào đoạn ADN đó và cắt cả hai sợi của phân tử ADN. Các enzym hạn chế thờng đợc sử dụng để cắt ADN: (i) Tạo đầu bằng, nh Sma
I, EcoR V cắt hai sợi ADN tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính nh EcoR I, Sac I cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.
Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế có sự tham gia của các thành phần: 1 μl dung dịch đệm; 2 μl ADN (~20 ng); 0,25 μl enzym hạn chế; 6,75 μl H2O khử ion vô trùng. Hỗn hợp phản ứng đợc trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (thờng ở 370C, 2 giờ). Sản phẩm phản ứng đợc kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza ở nồng độ thích hợp.
2.2.7 Điện di
2.2.7.1Điện di ADN trên gel agaroza
Các đoạn ADN có khối lợng và điện tích khác nhau đợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dơng của máy điện di trong một điện trờng có điện thế và cờng độ thích hợp. Hoá chất điện di: agaroza 0,8-1,4% (phụ thuộc vào kích thớc phân tử ADN), dung dịch đệm TBE 5X (Tris base: 54 g, axit boric: 27,5 g, EDTA 0,5 M pH 8,0: 20 ml), bromit ethidium (ethidium bromide - EtBr): 10 mg/ ml, đệm tra mẫu (Loading buffer - 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glyxerol 100% và dẫn bằng nớc đến 1 ml). Quy trình điện di nh sau:
(1) Chuẩn bị gel agaroza: cho 0,8 - 1 g agaroza vào 100 ml dung dịch TBE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội xuống khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay gel điện di có cài sẵn răng lợc. Sau 30-60 phút, khi gel đã đông cứng, đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2 mm, gỡ lợc ra.
(2) Mẫu ADN đợc trộn với 3 àl đệm tra mẫu và đợc tra vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di (30-40 V, 60-80 mA) cùng chỉ thị phân tử ADN chuẩn (bảng 2.7) để xác định trọng lợng phân tử, quan sát sự di chuyển màu để ngừng quá trình điện di.
(3) Bản gel đợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn, ngâm 30 - 45 phút trong dung dịch n- ớc có EtBr nồng độ 0,5 àg/ ml trên một máy lắc nhẹ, rửa bằng H2O, quan sát dới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.
Bảng 2.7.Chỉ thị phân tử ADN chuẩn 1 kb và ADNλ/ EcoR I + Hind III
Băng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 14 1 kb 10 8 6 5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,75 0, 5 0,25 ADNλ 21,226 5,148 4,973 4,268 3,530 2,027 1,904 1,584 1,375 0,947 0,831 0,55 4