Chơng 2 vật liệu và phơng pháp 2.1vật liệu và hoá chất, thiết bị máy móc
2.2.11.3 Biến nạp Ti-plasmit vào tế bào A tumefaciens bằng phơng pháp phối ba bố mẹ (Tri-parental mating method)
phối ba bố mẹ (Tri-parental mating method)
Phơng pháp này đợc sử dụng để chuyển Ti-plasmit, đặc biệt là vectơ liên hợp, từ tế bào E. coli sang tế bào A. tumefaciens với các bớc: (1) Nuôi cấy ba chủng vi khuẩn bố mẹ (chủng E. coli trợ giúp có phổ vật chủ rộng, chủng E. coli chứa vectơ chuyển gen thực vật và chủng A. tumefaciens nhận) trên đĩa môi trờng LB/ YEP có bổ sung kháng sinh chọn lọc ở nhiệt độ và thời gian thích hợp; (2) Nuôi cấy lắc một khuẩn lạc của mỗi chủng vi khuẩn trên trong 2 ml môi trờng LB/ YEP lỏng có bổ sung kháng sinh và ở nhiệt độ thích hợp; (3) Ly tâm ở 1000 v/ p để thu cặn tế bào 3 chủng vi khuẩn, hoà cặn trong môi trờng YEP lỏng không bổ sung kháng sinh (lợng môi trờng bổ sung phụ thuộc vào sự phát triển của từng chủng vi khuẩn); (4) Chuyển 300 μl dịch nuôi cấy mỗi chủng vi khuẩn này vào 1 ống eppendorf, nuôi cấy lắc ở 28 0C trong 4 giờ; (5) Chuyển 100 μl dịch nuôi cấy mỗi chủng vào một đĩa môi tr- ờng dùng cho tiếp hợp (H-agar), dùng que cấy gạt đều, phủ giấy lọc vô trùng và nuôi qua đêm ở 280C. Mẫu đối chứng là các chủng vi khuẩn đợc nuôi cấy riêng; (6) Bổ sung 3 ml 10 mM MgCl2 vô trùng vào mỗi đĩa môi trờng tiếp hợp, dùng que thủy tinh trộn đều và gạn chiết dịch vi khuẩn vào eppendorf vô trùng; (7) Pha loãng dịch vi khuẩn bằng 10 mM MgCl2 ở các nồng độ 100, 10-1, 10-2 và 10-3 (đối với mẫu thí nghiệm), 100, 10-1 (cho mẫu đối chứng); (8) Cấy gạt 50 - 100 μl mỗi mẫu pha loãng lên đĩa môi trờng YEP có chứa kháng sinh thích hợp, ủ ở 280C từ 2-3 ngày [].
2.2.12Tạo dòng phụ
Bao gồm các bớc: (1) Lập bản đồ cắt enzym hạn chế với các enzym nằm trong vùng MCS của vectơ tạo dòng thông dụng; (2) Cắt ADN với enzym hạn chế, điện di và tinh chế các đoạn ADN cần tạo dòng; (3) Mở vòng vectơ sử dụng enzym hạn chế tơng ứng; (4) Tiến hành phản ứng ghép nối, biến nạp vào tế bào vi khuẩn và tạo dòng [].
2.2.13Xác định trình tự nucleotit của gen
Trình tự ADN đợc xác định theo phơng pháp của Sanger & đtg [] trên máy xác định trình tự ADN tự động ALF Express sử dụng các đoạn mồi gắn huỳnh quang và bộ hoá chất chuẩn để nhân gen bằng PCR với Taq ADN polymeaza của Hãng Amersham Pharmacia Biotech. Chu trình nhiệt: 950C 2 phút, 950C 36 giây, 530C 36 giây, 720C 84 giây, lặp lại 25 chu kỳ từ bớc 2-4, kết thúc ở 40C. Sau đó, sản phẩm PCR đợc biến tính bằng nhiệt và phân tích trên máy xác định trình tự ADN.