3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.4.2 Tạo protein CryIA(c) tái tổ hợp trong vi khuẩn E col
Hệ thống biểu hiện gen nhờ vi khuẩn E. coli là hệ thống lý tởng đợc sử dụng để biểu hiện rất nhiều loại protein. E. coli dễ dàng đợc nuôi cấy và nhân lên trong môi trờng thông dụng.
Hình 3.27. Thiết kế vectơ biểu hiện pET21d-cryIA(c)
1. ADN λ/ EcoR I+Hind III 2. pET21d
3. pET12d-cryIA(c)
4. pET21d-cryIA(c)/ Nco I+BamH I 5. pET21d/ Nco I+BamH I
Một số phơng pháp truyền thống thờng đợc sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hoá protein tinh thể độc tố của Bt là phơng pháp điện di trên gel polyacrylamit và phơng pháp lai miễn dịch với kháng thể đa dòng kháng các loại protein tinh thể độc tố.
Theo những hớng nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vectơ pET21d-cryIA(c) vào tế bào E. coli chủng BL21(DE3) (chủng có khả năng biểu hiện cao) và biểu hiện protein tái tổ hợp trong môi trờng nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng 1mM IPTG. Sinh khối tế bào sau 3 giờ nuôi cấy đợc phá vỡ bằng siêu âm trong dung dịch lysozyme có chứa 0.1mM PMSF (phenyl metasulphonyl fluoride). Quá trình biểu hiện gen đợc xác định qua việc xuất hiện phân tử protein mới ở cặn tế bào trên gel điện di SDS-PAGE. Protein CryIA(c) tái tổ hợp đợc tinh chế bằng phơng pháp điện di đẩy ra khỏi gel trong túi thẩm tích nhờ điện trờng.
Các nghiên cứu cho thấy những phân tử protein độc tố do nhóm gen cryIA mã hoá thờng tồn tại ở dạng tiền độc tố và chứa tới hơn 80% trình tự tơng đồng. Tiền độc tố CryIA có kích thớc phân tử khoảng 130-140kDa và bao gồm hai phần: phần đầu N mang độc tính với kích thớc khoảng 60-70 kDa và phần đầu C kích thớc khoảng 60-70 kDa giàu cystein liên quan đến quá trình kết tinh của độc tố [], []. Gen cryIA(c) chúng tôi sử dụng đã đợc cải biến cắt bớt phần gen mã hoá cho đầu C chỉ giữ lại phần gen mã hoá cho protein độc tố có kích thớc theo tính toán lý thuyết là 68,635 kDa (không kể methionin thờng bị loại bỏ sau dịch mã). Nh vậy, băng protein mới xuất hiện đậm nét trên gel SDS-PAGE có kích thớc khoảng 68 kDa tơng ứng với kích thớc của đoạn mang tính độc (cột 4, 6, hình 3.28).
3.5 Lai miễn dịch và sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) 3.5.1 Lai miễn dịch
Rất nhiều chủng Bt tự nhiên đã đợc xác định chứa nhiều protein tinh thể độc tố nhờ phơng pháp lai miễn dịch với kháng thể đa dòng. Để khẳng định chính xác băng protein mới xuất hiện là CryIA(c), chúng tôi đã tiến hành làm phản ứng lai miễn dịch sử dụng kháng thể kháng CryIA(c) chuẩn do GS. Supat, Thái Lan cung cấp.
Kết quả lai dơng tính trên hình 3.29 cho thấy, gen cải biến cryIA(c) đã đợc biểu hiện mạnh ở E. coli chủng BL21 (DE3) với hệ vectơ pET21d, protein tái tổ hợp khá ổn định và không bị phân huỷ. Băng protein chính xuất hiện trên cột 3 có kích thớc phân tử phù hợp với kích thớc phân tử của CryIA(c) theo tính toán lý thuyết. Đặc biệt, CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế đã lai rất đặc hiệu với kháng thể là
Hình 3.28. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen cryIA(c) và tinh chế protein CryIA(c) tái tổ hợp
1. Chỉ thị phân tử chuẩn
2. Protein tổng số của E. coli (đối chứng)
3. Protein tổng số chủng E. coli mang gen cryIA(c) 4. Cặn tế bào sau khi xử lý bằng lysozym
5. Dịch nổi tế bào sau khi xử lý bằng lysozym 6. Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế
protein tái tổ hợp chúng tôi sử dụng để phát hiện CryIA(c). Sản phẩm lai chỉ xuất hiện một băng duy nhất (cột 2).
Việc biểu hiện thành công gen cry trong E. coli có một ý nghĩa vô cùng quan trọng. Đặc biệt khi vectơ Ti-plasmit mang kết cấu gen Ubi-cryIA(c) do chúng tôi thiết kế đã và đang đợc chuyển vào lúa và các loại cây trồng khác. Ngoài ra, các nghiên cứu chuyển gen cry trên đối tợng cây ngô đã đợc triển khai trong chơng trình hợp tác với Viện Nghiên cứu Ngô. Phơng pháp phát hiện protein tinh thể độc tố trong các cây lúa, ngô chuyển gen … cry cần phải có kháng thể (sản xuất trên cơ sở protein Cry tái tổ hợp). Nh vậy, protein Cry tái tổ hợp sẽ đợc sử dụng để kiểm tra các cây trồng chuyển gen này. Hơn nữa, Cry tái tổ hợp cũng có thể dùng trong mô hình thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu tác động của protein tinh thể
Hình 3.29. Lai miễn dịch protein CryIA(c) tái tổ hợp với kháng thể kháng CryIA(c)
1. Chỉ thị phân tử chuẩn
2. Lai miễn dịch protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế 3. Lai miễn dịch protein tổng số của E. coli mang gen cryIA(c)
độc tố lên các loài côn trùng khác nhau. Qua kết quả lai miễn dịch này, có thể khẳng định chúng tôi đã thành công trong việc biểu hiện gen cryIA(c) ở vi khuẩn E. coli.