3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.1.3 Tạo dòng đoạn khởi động của ge nm hoá sucroza synthaza ã
giống lúa C71
Sản phẩm PCR thu đợc từ giống lúa C71 đợc gắn trực tiếp vào vectơ pUC118 (trớc đó đã đợc mở vòng bằng Hinc II) và biến nạp vào E. coli chủng DH5α. Vectơ pUC118 có một điểm cắt của BamH I nằm bên trái vị trí nhận biết Hinc II. Nh đã trình bày, trong trình tự của đoạn mồi SUC-B, chúng tôi có thiết kế thêm một điểm cắt của enzym này. Nếu nh sản phẩm PCR đợc gắn xuôi chiều thì khi xử lý bằng
BamH I sẽ xuất hiện một băng kích thớc bằng C71S-P (cột 2, hình 3.8). Kết quả điện di sau khi cắt dòng pUC118-C71S-P bằng BamH I cho thấy plasmit tái tổ hợp này có
mang đoạn ADN có kích thớc phân tử tơng đơng với sản phẩm PCR (cột 4, hình 3.8).
Để kiểm tra cấu trúc của plasmit tái tổ hợp pUC118-C71S-P, chúng tôi cũng đã tiến hành phân tích bản đồ enzym hạn chế của plasmit này. Vectơ pUC118 có một điểm cắt của EcoR I nằm bên trái vị trí nhận biết của Hinc II (nơi sản phẩm PCR đợc gắn vào). Trong C71S-P cũng có một điểm cắt của enzym này. Tuỳ thuộc vào chiều gắn của C71S-P vào vectơ, sản phẩm cắt sẽ là hai băng có kích thớc khoảng 0,65 kb, 4,5 kb (trờng hợp 1), hoặc 1,3 kb, 3,85 kb (trờng hợp 2 - khi C71S- P gắn theo chiều ngợc lại). Kết quả nhận đợc cho thấy, EcoR I đã cắt plasmit thành
Hình 3.8. Tạo dòng đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 2. C71S-P
3. C71S-P/ BamH I
hai băng đúng nh trờng hợp 1. Khi xử lý plasmit tái tổ hợp bằng Pst I và Pvu II, chúng tôi cũng nhận đợc kết quả tơng tự với tính toán lý thuyết (cả hai enzym này đều cắt plasmit thành ba đoạn có kích thớc phù hợp nh trên). Trên cơ sở những phân tích này chúng tôi khẳng định đã tạo dòng đợc C71S-P từ giống lúa C71. Chúng tôi đã tiến hành tách chiết và tinh chế một lợng lớn vectơ này để tạo các dòng phụ và đọc trình tự nucleotit của C71S-P.