3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.2.3.1 Thiết kế vectơ pCAMBIA1300 chứa kết cấu gen C71S-P-cryIA(c)
Rao & đtg [] đã dùng Rsuc1-P để điều khiển quá trình biểu hiện gen lectin của cây hoa điểm tuyết ở lúa. Sử dụng kỹ thuật định vị miễn dịch huỳnh quang protein (immunohistochemical localization), nhóm nghiên cứu trên đã khẳng định rằng đoạn khởi động này đã điều khiển sự biểu hiện đặc hiệu của GNA bó mạch của cây lúa chuyển gen mà không biểu hiện ở những nơi khác. Kết quả tơng tự nhận đợc khi Sudhakar & đtg sử dụng Rsuc1-P để điều khiển biểu hiện gen trong một số giống lúa châu á []. Ưu điểm của Rsuc1-P là cơ sở để chúng tôi thiết kế kết cấu gen C71S-P-cryIA(c) và chuyển vào lúa nhằm tạo cây lúa có khả năng kháng sâu đục thân chỉ khu trú tại mô cây bị hại.
C71S-P nằm trong vectơ tạo dòng pUC118. C71S-P đợc gắn trực tiếp vào pUC118 tại vị trí Hinc II. Bên trái vị trí nhận biết này trong vectơ pUC118 có một điểm cắt của BamH I. Trong trình tự của đoạn mồi dùng để nhân C71S-P, chúng tôi cũng đã thiết kế thêm một điểm cắt của BamH I. Do vậy, toàn bộ đoạn khởi động này sẽ đợc tách ra khỏi vectơ tạo dòng khi xử lý pUC118-C71S-P bằng enzym BamH I.
Sản phẩm cắt của pUC118-C71S-P/ BamH I đợc điện di trên gel agaroza nồng độ thấp 0,7% nhằm tách rời băng chứa C71S-P và băng chứa pUC118. Sau đó, chúng tôi thu hồi C71S-P và dùng làm nguyên liệu cho phản ứng gắn vào Ti-plasmit pCAMBIA1300-cryIA(c) trớc đó đã đợc xử lý với một lợng lớn cũng bằng BamH I và loại bỏ nhóm phosphat.
Sản phẩm gắn nối pC1300-C71S-P-cryIA(c) đợc biến nạp vào tế bào E. coli
(chủng DH5α) theo phơng pháp sốc nhiệt với sự chọn lọc trên môi trờng LB có chứa 50 àg/ ml Km. Mục đích của quá trình biến nạp này nhằm chọn lọc và nhân plasmit lên trong E. coli tạo lợng lớn để chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả cho thấy có 50 khuẩn lạc xuất hiện trên hai đĩa petri chứa môi trờng LB + Km (chúng tôi ký hiệu các khuẩn lạc này là TiC71S1→TiC71S50). Từ các khuẩn lạc thu đợc, chúng tôi đã tách chiết Ti-plasmit và cắt kiểm tra bằng enzym hạn chế. Hình 3.23 là kết quả phân tích bằng BamH I của ADN plasmit tách từ một số khuẩn lạc. ở các khuẩn lạc TiC71S15, TiC71S16, TiC71S20, TiC71S31, TiC71S32 (kênh 4, 5, 7, 11, 12, hình 3.18) không có sự ghép nối của C71S-P vào vectơ. Trong khi đó, rõ ràng là
Hình 3.18. Các dòng plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c)
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 7. pTiC71S20/ BamH I 2. pC1300-cryIA(c)/ BamH I 8. pTiC71S24/ BamH I
3. C71S-P 9. pTiC71S27/ BamH I
4. pTiC71S15/ BamH I 10. pTiC71S30/ BamH I 5. pTiC71S16/ BamH I 11. pTiC71S31/ BamH I 6. pTiC71S17/ BamH I
các sản phẩm cắt của pTiC71S17, pTiC71S24, pTiC71S27 và pTiC71S30 (kênh 6, 8, 9, 10, hình 3.18) gồm hai băng có kích thớc khoảng 11 kb và 2 kb tơng ứng với plasmit pC1300-cryIA(c) ở dạng mạch thẳng và đoạn C71S-P đúng nh tính toán lý thuyết. Chúng tôi đã sử dụng các khuẩn lạc mang vectơ pC1300-C71S-cryIA(c) để kiểm tra chiều gắn của đoạn khởi động này trong vectơ.