3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.3.1 Tạo chủng A tumefaciens mang các Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300 Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) bằng phơng pháp xung điện
Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) bằng phơng pháp xung điện
Phơng pháp chuyển gen trực tiếp vào tế bào A. tumefaciens qua xung điện hay sốc nhiệt đều cần tạo tế bào khả biến. Mặc dù phơng pháp sốc nhiệt tiến hành khá đơn giản nhng hiệu quả tơng đối thấp nên với các thiết bị của Phòng máy chung của Viện Công nghệ Sinh học, chúng tôi đã sử dụng phơng pháp xung điện để chuyển Ti-plasmit mang các kết cấu gen thiết kế đợc vào tế bào A. tumefaciens.
Để có tế bào khả biến A. tumefaciens, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy lại các chủng vi khuẩn trên môi trờng thạch đặc YEP trớc khi cấy chuyển liên tiếp hai lần sang môi trờng lỏng có bổ sung 0,1 % glucoza.
Sau khi xử lý bằng xung điện (ở điều kiện 25 àF; 400 Ω; 2,42 kV; 8-10 ms), mẫu thí nghiệm và đối chứng đều đợc phục hồi ngay trong môi trờng tăng cờng. Trên các môi trờng chọn lọc (YEP + Km cho chủng EHA105 và YEP + Km + Rifampicin (Rf) + Carbenicillin (Cb) cho chủng LBA4404) sau hai ngày nuôi cấy, chúng tôi đã thu đợc khá nhiều khuẩn lạc. Hình 3. 23 là kết quả xung điện chuyển Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c) vào tế bào A. tumefaciens chủng EHA105.
Hình 3.23. Kết quả xung điện tạo chủng A. tumefaciens EHA105 chứa pC1300-Ubi-cryIA(c)
Các khuẩn lạc A. tumefaciens tạo đợc nhờ xung điện có chứa Ti-plasmit tái tổ hợp đợc phát hiện bằng phơng pháp chọn lọc trên môi trờng đặc hiệu, tách chiết ADN plasmit, biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành các thí nghiệm phân tích
phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bớc biến nạp trở lại ADN plasmit vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lợng bản sao của plasmit tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đa vào. Chỉ trong một số trờng hợp, lợng ADN plasmit trong tế bào A. tumefaciens đủ để cắt enzym hạn chế và điện di sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử thông thờng của Sambrook & đtg [].
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành PCR. Đây là phơng pháp đơn giản cho phép khẳng định và xác định chính xác cấu trúc của plasmit tái tổ hợp đợc biến nạp vào A. tumefaciens. Giống nh các PCR thông thờng, hiệu quả phản ứng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: trình tự mồi, nồng độ Mg+, nhiệt độ và thời gian của các chu kỳ phản ứng Theo Walkerpeach … & Velten, cặp mồi để nhân CaMV35S-P và NOST chứng minh sự có mặt của plasmit tái tổ hợp trong Agrobacterium và tế bào thực vật chuyển gen là cặp mồi đợc sử dụng nhiều và cho hiệu quả rất cao [].
CaMV35SP: 5’- TCTGTCACTTCATCAAAAGGACAG-3’ NOST: 5’- GAATCCTGTTGCCGTCTTG-3’
Với cặp mồi nhân C71S-P có sẵn, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn khởi động này ở cấu trúc gen mới thiết kế đợc sử dụng ADN khuôn là plasmit tái tổ hợp tách chiết từ tế bào A. tumefaciens. Kết quả PCR trên hình 3. 24 cho thấy, chúng tôi đã đa đợc plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c) vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp đợc chúng tôi lu giữ dùng làm nguyên liệu để chuyển vào cây trồng.
Nh vậy, chúng tôi đã nhận đợc các dòng vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 và LBA4404 có chứa plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c)/ pC1300- C71S-cryIA(c) dùng làm nguyên liệu để chuyển gen cry vào lúa.
3.3.2 Tạo chủng A. tumefaciens mang Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-
cryIA(c)/ pC1300-C71S-P-cryIA(c) bằng phơng pháp phối ba bố mẹ
Phơng pháp phối ba bố mẹ thờng đợc sử dụng để chuyển các vectơ Ti- plasmit, đặc biệt là vectơ liên hợp, từ tế bào E. coli sang tế bào A. tumefaciens. Chúng tôi đã sử dụng quy trình phối ba bố mẹ theo mô tả của Van Haute & đtg [] với một vài cải biến nhỏ để chuyển các Ti-plasmit tái tổ hợp từ tế bào E. coli sang tế bào A. tumefaciens. Trong trờng hợp chuyển pC1300-Ubi-cryIA(c), ba chủng vi khuẩn chúng tôi sử dụng trong tiếp hợp là:
(1) Chủng E. coli HB101 mang plasmit pRK2013 đảm nhận chức năng trợ giúp;
Hình 3.24. Kiểm tra sự có mặt của Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c) trong tế bào A. tumefaciens
1. C71S-P
(2) Chủng E. coli HB101 mang vectơ pC1300-Ubi-cryIA(c);
(3) Chủng A. tumefaciens nhận: LBA4404 (pGA3850) hoặc EHA105. Trong trờng hợp này, chúng tôi không sử dụng chủng EHA101 để tiếp hợp do chúng mang chỉ thị chọn lọc (gen kháng Km) tơng đồng với chỉ thị chọn lọc của pC1300-Ubi-cryIA(c). Tính kháng Km trùng nhau nên không thể chọn lọc đợc các dòng A. tumefaciens EHA101 tái tổ hợp.
Ba chủng vi khuẩn bố mẹ đợc nuôi cấy trên đĩa môi trờng LB/ YEP có bổ sung kháng sinh chọn lọc ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau đó, chúng tôi nuôi cấy lắc một khuẩn lạc của mỗi chủng vi khuẩn trong 2 ml môi trờng LB/ YEP lỏng có bổ sung kháng sinh ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để chuẩn bị mẫu tiếp hợp. Nhằm tăng hiệu quả của quá trình tiếp hợp, chúng tôi đã chuyển 300 μl dịch nuôi cấy mỗi chủng vi khuẩn này vào chung một ống eppendorf, nuôi cấy lắc ở 280C trong 4 giờ. Trên đĩa môi trờng dùng cho tiếp hợp (H-agar), 100 μl dịch nuôi cấy ba chủng vi khuẩn bố mẹ đợc gạt đều bằng que gạt và phủ giấy lọc vô trùng, nuôi qua đêm ở 280C. Sau quá trình tiếp hợp, chúng tôi đã tiến hành chọn lọc các dòng tế bào
A. tumefaciens mang plasmit tái tổ hợp [].
Vì tế bào A. tumefaciens có tốc độ sinh trởng chậm hơn tế bào E. coli nên trong các bớc nuôi cấy vi khuẩn chúng tôi thờng nuôi A. tumefaciens trớc một ngày. Chúng tôi cũng luôn bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp vào môi trờng LB/ YEP (lỏng, đặc) nhằm duy trì sự tồn tại của tất cả các plasmit trong tế bào E. coli và
Agrobacterium. Môi trờng LB + Km để nuôi cấy hai chủng E. coli, môi trờng YEP + Rif + Cb để nuôi cấy chủng A. tumefaciens nhận LBA4404, môi trờng YEP để nuôi cấy EHA105. Tuy nhiên trong một số lần thí nghiệm, trớc khi tiến hành tiếp hợp, chúng tôi ly tâm dịch nuôi cấy của ba chủng vi khuẩn để thu cặn tế bào, sau đó hoà lại trong môi trờng YEP lỏng không chứa kháng sinh nhằm tăng khả năng sinh trởng và tiếp hợp của các chủng vi khuẩn. Tuỳ thuộc vào sự phát triển của từng chủng vi khuẩn, chúng tôi tính toán lợng môi trờng cho phù hợp để hoà cặn tế bào.
Bên cạnh mẫu thí nghiệm (trộn 0,1ml dịch nuôi cấy ba chủng vi khuẩn vào đĩa môi trờng tiếp hợp), chúng tôi cũng tiến hành bố trí mẫu đối chứng (gạt riêng rẽ
từng chủng vi khuẩn). Sau khi nuôi cấy, các đĩa thí nghiệm và đối chứng đều đợc bổ sung 3 ml dung dịch MgCl2 10mM, gạn dịch vi khuẩn và pha loãng ở các nồng độ, cấy trải trên các đĩa môi trờng không chứa/ chứa kháng sinh chọn lọc vectơ pC1300- Ubi-cryIA(c). Ví dụ, khi sử dụng chủng LBA4404 làm chủng nhận, ngoài kháng sinh Rf và Cb của chủng gốc, môi trờng chọn lọc các thể sau tiếp hợp còn bổ sung Km. Mẫu sẽ đợc cấy trải trên các đĩa môi trờng: (1) YEP + Rf + Cb + Km; (2) YEP + Km; (3) YEP + Rf + Cb. Tơng tự, đối với chủng EHA105, môi trờng sau tiếp hợp bao gồm: (1) YEP; (2) YEP + Km. Kết quả, chúng tôi đã nhận thấy sự xuất hiện của các khuẩn lạc sau tiếp hợp.
Đối với trờng hợp sử dụng EHA105 làm chủng nhận: do hai chủng E. coli
(chủng trợ giúp và chủng mang vectơ tái tổ hợp) đều kháng Km, bản thân chủng EHA105 lại không chứa gen chỉ thị chọn lọc. Vì vậy, các dòng vi khuẩn sau tiếp hợp chúng tôi quan sát thấy cả các dòng E. coli. Trong khi ở trờng hợp sử dụng LBA4404, cả hai chủng E. coli đều không kháng Rf và Cb nên các khuẩn lạc mọc đ- ợc trên môi trờng chọn lọc có đủ kháng sinh Rf + Cb + Km là vi khuẩn
Agrobacterium tái tổ hợp. Các dòng E. coli nhiễm sau quá trình phối ba bố mẹ đợc chúng tôi loại bỏ nhờ quan sát về mặt hình thái đồng thời cấy ria trên các môi trờng chọn lọc, nuôi ở nhiệt độ thấp (280C)/ cao (370C). Cơ sở của thí nghiệm kiểm tra này dựa trên các đặc tính khác biệt của vi khuẩn A. tumefaciens so với vi khuẩn E. coli.
Khuẩn lạc A. tumefaciens có hình thái khá đặc biệt: trơn, bóng và nhô cao khỏi mặt thạch.... Hơn nữa, chúng sinh trởng rất yếu, thậm chí không phát triển đợc khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao. Sau khi sơ bộ chọn lọc qua hình thái khuẩn lạc, dòng các tế bào
A. tumefaciens đợc chúng tôi nuôi cấy và kiểm tra sự có mặt của vectơ và cấu trúc gen quan tâm theo các phơng pháp của Walkerpeach & Velten [] (hình 3.25).
Cột 1 (hình 3.25) là ADN plasmit tách chiết đợc từ chủng A. tumefaciens
LBA4404 (pGV3850), cột 3 là ADN plasmit sau khi đợc biến nạp trở lại trong E. coli. Sản phẩm xử lý ADN plasmit này bằng Hind III (cột 4) đã xuất hiện một băng có kích thớc khoảng 4,1 kb tơng ứng với kết cấu gen Ubi-cryIA(c)-NOST và kết quả
cắt bởi BamH I (cột 5) là một băng kích thớc khoảng 2 kb tơng ứng với đoạn khởi động Ubiquitin.
Chúng tôi cũng thí nghiệm khả năng chuyển plasmit vào tế bào A. tumefaciens theo hai bớc phối đôi (two bi-parental matings). Đầu tiên, chủng vi khuẩn E. coli cho và chủng E. coli trợ giúp đợc tiếp hợp trên đĩa môi trờng chứa kháng sinh chọn lọc cho tất cả các plasmit có mặt. Dòng vi khuẩn E. coli sau bớc tiếp hợp này đợc sử dụng để tiếp hợp với chủng A. tumefaciens nhận.
Rõ ràng, phơng pháp xung điện có u điểm: (i) thời gian thí nghiệm ngắn (từ 2-3 ngày); (ii) các thể sau biến nạp hoàn toàn không có khả năng bị nhiễm các tế
Hình 3.25. Kiểm tra sự có mặt của Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c) trong tế bào A. tumefaciens
1. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong LBA4404 2. Chỉ thị phân tử 1 kb
3. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli
4. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli/ HindIII 5. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli/ BamH I
bào E. coli. Trong khi, phơng pháp phối ba bố mẹ tuy không cần các thiết bị thí nghiệm đắt tiền (tủ lạnh -850C, máy xung điện với điện thế cao) và có thể tiến hành ở mọi phòng thí nghiệm nghiên cứu về vi sinh vật nhng với một số nhợc điểm nh phải duy trì các chủng vi sinh, thời gian biến nạp tơng đối dài (4-7 ngày) và dễ nhiễm nên không đợc sử dụng rộng rãi. Trong điều kiệnViệt Nam, phơng pháp phối ba bố mẹ với những u điểm trên, cũng đã đợc áp dụng để đa Ti-plasmit vào tế bào
Agrobacterium []. Nh vậy, trên cơ sở các phơng pháp chuyển Ti-plasmit từ tế bào E. coli vào tế bào A. tumefaciens đã đợc chúng tôi hoàn thiện, vấn đề tạo chủng A. tumefaciens mang Ti-plasmit tái tổ hợp có thể đợc thực hiện dễ dàng trong điều kiện Việt Nam.
3.3.3 Quy trình bảo quản giống vi khuẩn E. coli và A. tumefaciens tái tổ hợp
Nuôi cấy và lu giữ các chủng vi khuẩn là một trong những bớc quan trọng của kỹ thuật thiết kế vectơ chuyển gen thực vật. Các chủng vi khuẩn tái tổ hợp cần đợc kiểm tra định kỳ nhằm đảm bảo plasmit đợc duy trì và giảm khả năng nhiễm các loài vi sinh vật khác. Các chất kháng sinh thích hợp cần đợc bổ sung vào môi tr- ờng nuôi cấy nhằm tạo áp lực chọn lọc để loại bỏ các tế bào không mang vectơ trong quá trình phân chia. Căn cứ vào loại plasmit mà vi khuẩn mang, các chủng vi khuẩn mang các vectơ tái tổ hợp sau thiết kế đợc chúng tôi nuôi cấy trên các môi tr- ờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó giữ ở -750C phục vụ cho các thí nghiệm chuyển gen vào cây trồng. Đối với các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp, vì tốc độ sinh trởng chậm và chịu sự chọn lọc của nhiều loại kháng sinh, nên để phục hồi nhanh chóng các tế bào đang lu giữ ở -750C, chúng tôi thờng tiến hành làm mới lại giống bằng cách cấy lắc trên môi trờng lỏng trớc khi chọn lọc các khuẩn lạc đơn. Trong một số ít trờng hợp, nếu bớc phục hồi này không hiệu quả thì A. tumefaciens cần đợc cấy tiếp sang môi trờng lỏng và lắc trong khoảng 2 ngày ở 280C. Môi trờng nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi khuẩn tái tổ hợp đã tạo đợc tóm tắt trên bảng 3.13.
Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mới đợc chúng tôi chuyển giao cho Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học nhằm chuyển có
định hớng vào các giống cây trồng quan trọng của Việt Nam. Hàng loạt dòng lúa mang gen cry đã đợc kiểm tra sự có mặt của gen cry và trồng thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, trong khuôn khổ hợp tác với Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc BNN & PTNN), plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) cũng đã đợc các cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Sinh học chuyển vào một số giống ngô Việt Nam [Hợp đồng chuyển giao nguyên liệu, phụ lục 1]. Các dòng ngô tái tổ hợp này đang đợc kiểm tra, tái sinh thành cây hoàn chỉnh và nghiên cứu khả năng kháng sâu hại.
Bảng 3.13. Môi trờng nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi khuẩn mang các plasmit tái tổ hợp
Chủng Môi trờng Nồng độ kháng sinh chọn lọc (μg/ ml)
Amp Km Cb Rf
DH5α
(pC1300- cryIA(c))/ (pC1300- C71S-cryIA(c))/
(pNOV- Ubi-cryIA(c))
LB + Km - 50 - -
HB101
(pC1300-Ubi-cryIA(c))
LB + Km - 50 - -
LBA4404
(pC1300-Ubi-cryIA(c))/ (pC1300-C71S-cryIA(c))
YEP + Km
+ Rf + Cb - 50 100 100
EHA105
(pC1300-Ubi-cryIA(c))/ (pC1300-C71S-cryIA(c))
YEP + Km - 50 - -
3.4 biểu hiện gen cryIA(c) TrONG VI Khuẩn e. coli
ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen thực vật, bao gồm gen Bt và một số gen khác mới đợc bắt đầu vài năm gần đây [], [], [], []. Kỹ thuật PCR thờng đợc sử dụng để đánh giá sơ bộ sự có mặt của GOI nói chung và gen cry nói riêng trong cây trồng. Tuy nhiên, kết quả cuối cùng cần phải khẳng định là các cây đợc chuyển gen có khả năng biểu hiện gen chuyển thành sản phẩm protein có tính kháng sâu nhờ kỹ
thuật lai miễn dịch protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu cho protein Cry của loại gen đợc chuyển vào cây. Vì vậy, chúng tôi đặt vấn đề thiết kế vectơ và biểu hiện gen cryIA(c) trong E. coli với mục đích tạo và tinh chế protein CryIA(c) tái tổ hợp để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm sử dụng để kiểm tra sự có mặt của protein cryIA(c) ở các cây trồng đợc chuyển gen.