3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.2.3.2 Kiểm tra chiều gắn của đoạn khởi động C71S-P trong Ti plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c)
plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c)
Các Ti-plasmit có chứa C71S-P nh pTiC71S17, pTiC71S24, pTiC71S27 và pTiC71S30 tiếp tục đợc kiểm tra bằng cách xử lý với Pst I. Vectơ pCAMBIA1300 không có điểm nhận biết của Pst I. Tuy nhiên, trong trình tự đoạn C71S-P có hai vị trí cắt của Pst I và trong trình tự gen cryIA(c) cũng có hai vị trí cắt của enzym này. Sản phẩm cắt theo tính toán lý thuyết đợc trình bày trên hình 3.19.
Tr
ờng hợp gắn xuôi chiều (hình 3.19a):
Sản phẩm cắt bởi Pst I của pC1300-C71S-cryIA(c) sẽ là bốn băng với các kích thớc nh sau:
1. 938 bp: Băng tơng ứng với đoạn trình tự nằm trong C71S-P.
2. 2262 bp (828 bp + 1434 bp): Băng tơng ứng với một phần đoạn C71S-P (828 bp) và một phần đoạn gen cryIA(c) (1434 bp)
3. 360 bp: Đây là một phần của gen cấu trúc cryIA(c).
4. 9433 bp (8958 bp +175 bp + 300 bp): Bao gồm toàn bộ vectơ pCAMBIA1300 (8958 bp), phần còn lại của C71S-P (175 bp) và phần kết thúc của gen cryIA(c) (~300 bp).
Tr
ờng hợp gắn ng ợc chiều (hình 3.19b):
Sản phẩm cắt bởi Pst I của pC1300-C71S-cryIA(c) cũng sẽ là bốn băng nhng với các kích thớc nh sau:
2. 1609 bp (175 bp + 1434 bp): Băng tơng ứng với một phần đoạn C71S-P (175 bp) và một phần đoạn gen cryIA(c) (1434 bp).
3. 360 bp: Đây là một phần của gen cấu trúc cryIA(c).
4. 10086 bp (8958 bp +828 bp + 300 bp): Bao gồm toàn bộ vectơ pCAMBIA1300 (8958 bp), một phần của C71S-P (828 bp) và phần kết thúc của gen cryIA(c) (~300 bp).
a)
b)
Hình 3.19. Sơ đồ xác định chiều gắn của C71S-P trong pC1300-C71S-cryIA(c)
a. C71S-P gắn xuôi chiều so với cryIA(c) b. C71S-P gắn ngợc chiều so với cryIA(c)
Rõ ràng, sự khác biệt giữa hai cách gắn chủ yếu đợc nhận biết thông qua sự xuất hiện của băng ADN có kích thớc khoảng 2,3 kb (cách gắn xuôi chiều) và băng khoảng 1,6 kb (cách gắn ngợc chiều). Kết quả thí nghiệm trên hình 3.20 cho thấy, ở các plasmit tái tổ hợp pTiC71S8 (cột 4) và pTiC71S24 (cột 6), C71S-P đã đợc gắn vào trong vectơ pC1300-cryIA(c) theo kiểu xuôi chiều so với gen cryIA(c). Trong khi, ở các plasmit tái tổ hợp pTiC71S17 (cột 3), pTiC71S23 (cột 5), pTiC71S24 (cột 6), đoạn khởi động này đã đợc gắn theo kiểu ngợc chiều.
Nh vậy, chúng tôi đã thiết kế đợc Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c). Các dòng tế bào E. coli tái tổ hợp này cũng đợc chúng tôi giữ trong glycerol, ở -750C để làm nguyên liệu chuyển plasmit này vàovi khuẩn A. tumefaciens.
Cũng cần nhấn mạnh rằng, khi chúng tôi tiến hành thiết kế các vectơ Ti- plasmit mang gen cry, tại Viện Di truyền Nông nghiệp nhóm nghiên cứu của Đặng Trọng Lơng cũng đã tiến hành đa gen cryIA(c) vào vectơ hai nguồn pART27 và chuyển vào chủng A. tumefaciens GV2260. Trong đó, gen cry đợc
Hình 3.20. Kiểm tra chiều gắn của C71S-P trong pC1300-C71S-cryIA(c)
1. Chỉ thị phân tử 1 kb 4. pTiC71S8/ Pst I 2. pTiC71S4/ Pst I 5. pTiC71S23/ Pst I 3. pTiC71S17/ Pst I 6. pTiC71S24/ Pst I
điều khiển biểu hiện bởi đoạn khởi động CaMV35S tách từ vectơ pART7 [], []. CaMV35S-P là đoạn khởi động dạng cơ định hoạt động mạnh trong cây hai lá mầm và thờng đợc sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen vào cây hai lá mầm. Trong cây một lá mầm, CaMV35S-P cũng điều khiển biểu hiện gen nhng với mức độ hoạt động kém hơn []. Nghiên cứu của Datta & đtg cho thấy, mức độ biểu hiện của protein CryIA(b) ở lá và thân dới sự điều khiển của CaMV35S-P và đoạn khởi động của gen actin1 (actin1-P) ở lúa khác nhau không đáng kể [], []. Chúng đều điều khiển gusA biểu hiện khá mạnh ở nhiều loại mô nh rễ, lá và hạt (bảng 3.12) []. Nh vậy, sử dụng các đoạn khởi động này có thể tạo ra protein tái tổ hợp không định hớng. Trong một số trờng hợp khi đoạn khởi động cơ định điều khiển sản sinh protein độc tố Cry ở những bộ phận của thực vật, nơi không bị sâu hại tấn công, có thể gây hại đến quần thể côn trùng có ích.
Bảng 3.12. Mức độ biểu hiện của CaMV35S-P - gusA và Adh1-P - gusA
ở mô lúa chuyển gen []
Mô CaMV35S-P - gusA Adh1-P - gusA
Rễ + + + + + Lá + + + + Hoa Bao phấn _ + + Vòi nhị _ + + + Phấn hoa _ + + Bầu nhuỵ _ _ Hạt Phôi + + + + + Nội nhũ + + + +
ở Việt Nam, ngoài Đặng Trọng Lơng & đtg, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Uyển tại Viện Sinh học Nhiệt Đới, Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã tạo đợc các cây thuốc lá, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím bằng phơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 [], [], [], [], []. Hầu hết, các cây trồng biến đổi di truyền này mang gen bar,gen cryIA(c) và gen chỉ thị gusA
có nguồn gốc từ plasmit pITB2 đã đợc thiết kế sẵn. Ti-plasmit tái tổ hợp nh pITB2 mang đồng thời hai gen chỉ thị (gen bar kháng chất diệt cỏ và gen gusA) thờng chỉ đợc sử dụng trong các nghiên cứu ban đầu nhằm hoàn thiện phơng pháp chuyển gen cho từng đối tợng cây trồng nhất định. Nh vậy, những kết quả tạo Ti-plasmit tái tổ hợp đợc trình bày trong công trình này là những kết quả mới, rất có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn sản xuất, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về chuyển gen thực vật ở nớc ta.
Mặt khác, trong những năm gần đây, gen mã hoá protein tinh thể độc tố của
Bt với rất nhiều u điểm đã đợc nghiên cứu và chuyển thành công vào rất nhiều loài cây trồng. Thử nghiệm đồng ruộng đầu tiên của cà chua chuyển gen cry đã đợc Công ty Monsanto, Sandoz và Agrogenetics tiến hành ở Mỹ vào năm 1988. Sau đó, Crop Genetics International, Agracetus, Calgen…tiếp tục các thử nghiệm đồng ruộng trên ngô, thuốc lá, khoai tây. Nhờ khả năng kháng côn trùng đặc hiệu, từ năm 1996 cây bông chuyển gen cryIA(c) của Bt đã đợc đa vào sản xuất đại trà []. Nh vậy, với đoạn khởi động đặc hiệu bó mạch lần đầu tiên đợc phân lập và đa vào sử dụng ở Việt Nam, khả năng tạo ra lúa và các cây trồng khác mang gen kháng sâu nh cry đợc biểu hiện đặc hiệu ở những vị trí mong muốn có thể trở thành hiện thực.
3.2.4 Thiết kế vectơ chọn lọc tích cực mang kết cấu gen Ubi-cryIA(c)
Việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thờng cần sự có mặt của các gen chỉ thị nh các gen kháng kháng sinh, chất diệt cỏ.... Nhằm tránh sử dụng các gen kháng kháng sinh này, hệ thống chỉ thị chọn lọc tích cực “Positech” rất mới của Công ty Syngenta đã dựa trên gen mã hoá phosphomannoza isomeraza (PMI) làm chỉ thị và chọn lọc các thể sau biến nạp nhờ khả năng sinh trởng trên môi trờng chứa mannoza [].
Trên cơ sở Ubi-cryIA(c)-NOST và vectơ chọn lọc tích cực pNOV2819 nhận đợc từ Công ty Syngenta, chúng tôi đã tiến hành thiết kế plasmit tái tổ hợp mang gen
cry. Vectơ pNOV2819 với nhiều vị trí cắt duy nhất của enzym hạn chế giúp dễ dàng đa các gen quan tâm vào. Chúng chứa chỉ thị chọn lọc vi khuẩn là gen kháng Spectinomycin 50 μg/ ml nằm ngoài đoạn biên phải và trái. Đối với chỉ thị chọn lọc thực vật, gen mã hoá PMI kích thớc 514 bp đợc đoạn khởi động dạng cơ định CMPS (Cestrium Yellow Leaf Curling Virus) điều khiển biểu hiện mạnh ở các cây trồng thử nghiệm nh: ngô, lúa, lúa mỳ, đậu tơng, thuốc lá, cà chua, hớng dơng và cây cà. Với cặp mồi đặc hiệu để tiến hành PCR xác định sự có mặt của gen mã hoá PMI:
PMI-1 5’-ACAGCCACTCTCCATTCA-3’, PMI-2 5’-
GTTTGCCATCACTTCCAG-3’, plasmit tái tổ hợp dễ dàng đợc phát hiện trong các thể tái tổ hợp. Vùng MCS của pNOV2819 có vị trí cắt của enzym Hind III, do vậy, toàn bộ kết cấu gen Ubi-cryIA(c)-NOST có nguồn gốc từ plasmit pC1300-Ubi-
Hình 3.21. Sơ đồ thiết kế vectơ chọn lọc tích cực pNOV-Ubi-cryIA(c)
cryIA(c) đợc chúng tôi đa vào vectơ pNOV2819 dới dạng đoạn Hind III, kích thớc 4,1 kb. Sơ đồ thí nghiệm đợc trình bày trên hình 3.21.
Plasmit tái tổ hợp sau khi thiết kế đợc biến nạp vào chủng E. coli DH5α. Trên môi trờng LB có bổ sung Spectinomycin, chúng tôi đã thu đợc khá nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết ADN plasmit của các khuẩn lạc này. Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmit kích thớc lớn hơn pNOV2819, chúng tôi đã xử lý enzym hạn chế. Mẫu đối chứng là plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) cắt bởi các enzym tơng ứng. Theo tính toán lý thuyết, băng tơng ứng xuất hiện đồng thời ở mẫu đối chứng và thí nghiệm khi xử lý bằng EcoR I có kích thớc khoảng 2,2 kb (bao gồm kích thớc của gen cryIA(c) và một phần của đoạn khởi động Ubiquitin). Sản phẩm cắt tơng
Hình 3.22. Kết quả thiết kế vectơ chọn lọc tích cực pNOV-Ubi-cryIA(c)
1. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 2. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 3. Chỉ thị phân tử 1 kb
4. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ EcoR I 5. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ EcoR I
ứng bởi Hind III có kích thớc khoảng 4,1kb (kích thớc của kết cấu gen Ubi-
cryIA(c)-NOST). Kết quả trên hình 3.22 hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ chúng tôi đã đa đợc kết cấu gen cry vào vectơ pNOV2819 và tạo đợc plasmit tái tổ hợp pNOV-Ubi-cryIA(c).