3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.2.2 Thiết kế Ti-plasmit tái tổ hợp chứa gen cryIA(c) khuyết đoạn khởi động
động
Đoạn khởi động Ubiquitin trong cấu trúc Ubi-cryIA(c) là đoạn khởi động tách từ cây ngô, hoạt động rất mạnh trong cây một lá mầm. Trong các nghiên cứu chuyển gen trên đối tợng cây một lá mầm, Ubi-P đợc sử dụng nhiều hơn CaMV35S- P []. Tuy nhiên, chúng điều khiển biểu hiện gen ở rất nhiều mô lúa khác nhau []. Nhằm khống chế phạm vi ảnh hởng của protein tinh thể độc tố lên những loài côn trùng có ích, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm tách đoạn khởi động này khỏi vectơ pC1300-Ubi-cryIA(c) tạo cơ sở để thiết kế vectơ mang gen cryIA(c) dới sự điều khiển của các loại đoạn khởi động đặc hiệu nh C71S-P do chúng tôi phân lập đợc. Nhằm tăng cờng khả năng biểu hiện gen cũng nh giảm các ảnh hởng bất lợi, gen kháng côn trùng cần đợc biểu hiện ở những mô thực vật là nguồn thức ăn của côn trùng gây hại dới sự điều khiển của các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật [].
Chủng E. coli HB101 chứa plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) mang nguồn gen
cry đợc nuôi cấy lắc ở 370C trên môi trờng chọn lọc LB có bổ sung 50 àg/ ml Km để tiến hành tách chiết ADN plasmit. Bản đồ enzym hạn chế của pC1300-Ubi-cryIA(c) cho thấy Ubi-P, kích thớc 2020 bp, có thể bị cắt ra khi ADN plasmit đợc xử lý bằng
BamH I. Dựa trên kết quả phân tích này, chúng tôi đã tách chiết lợng lớn ADN plasmit và sử dụng BamH I để loại Ubi-P. Điện di sản phẩm ADN plasmit sau khi xử lý enzym, thu hồi phân đoạn ADN bao gồm vectơ pCAMBIA1300 khuyết Ubi-P bằng phơng pháp điện di đẩy ra khỏi gel trong túi thẩm tích nhờ điện trờng để tiến hành ghép nối trở lại và biến nạp vào tế bào E. coli. Trên môi trờng LB + Km chọn lọc, chúng tôi đã thu đợc khá nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết ADN plasmit của các khuẩn lạc này.
Sau đó, chúng tôi đã cắt plasmit tái tổ hợp bằng hai enzym là Hind III và
BamH I. Theo tính toán lý thuyết, nếu đoạn khởi động Ubiquitin đã bị loại, sản phẩm điện di chỉ xuất hiện hai băng: băng 8958 bp tơng ứng với vectơ pCAMBIA1300 và băng 2125 bp tơng ứng với kết cấu gen cryIA(c) khuyết Ubi-P. Kết quả phân tích enzym hạn chế của các Ti-plasmit pC1300-cryIA(c) dòng số 1, 2 và 3 đợc trình bày trên hình 3.17.
Kênh 2, 4 và 5 ngoài băng tơng ứng với vectơ pCAMBIA1300 (kích thớc khoảng 9 kb), chỉ còn lại một băng duy nhất khoảng 2,1 kb bao gồm đoạn gen cấu trúc cryIA(c) và đoạn kết thúc NOS. Nh vậy, chúng tôi đã thành công trong việc cắt Ubi-P ra khỏi vectơ pCAMBIA1300 chứa kết cấu gen cryIA(c). Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN plasmit lợng lớn để chuẩn bị cho bớc thiết kế vectơ mới mang C71S-P.
3.2.3 Thiết kế Ti-plasmit tái tổ hợp chứa gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động của gen m hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71ã