3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.1.5 Đọc trình tự nucleotit đoạn khởi động của ge nm hoá sucroza ã
synthaza ở giống lúa C71
Trình tự của C71S-P đợc xác định theo phơng pháp của Sanger & đtg []. Chúng tôi đã xác định trình tự từ hai chiều của tất cả các đoạn ADN có trong các plasmit tái tổ hợp của các dòng ban đầu và dòng phụ nhận đợc sử dụng đoạn mồi đọc xuôi và đọc ngợc. Bảng 3.9 trình bày các plasmit chúng tôi đã sử dụng để làm
Hình 3.9. Tạo các dòng phụ mang các đoạn cắt nhỏ của C71S-P
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 2. pBS/ Pst I 3. pUC118-C71S-P/ Ps tI 4. pBS-P11/ Pst I 5. pBS-P1 6. pBS-P1/ Pst I 7. pBS-P2/ Pst I 8. pUC-E1 9. pUC-E1/ EcoR I
phản ứng đọc trình tự và số lợng nucleotit đã xác định đợc từ hai chiều của mỗi đoạn ADN.
Bảng 3.9. Kết quả đọc trình tự các plasmit tái tổ hợp có gắn các đoạn hợp thành đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71
Plasmit Chiều dài trình tự đã đọc (số nucleotit)
Chiều xuôi Chiều ngợc
pBS-P1 799 764
pBS-P11 605 775
pUC-E1 899 -
pUC118-C71S-P 619 658
Nh vậy, từ plasmit pBS-P1 chúng tôi đã đọc đợc hai đoạn ADN: đoạn xuôi chiều dài 799 nucleotit và đoạn ngợc chiều dài 764 nucleotit. Tơng tự, hai trình tự đọc đợc từ hai chiều của plasmit pBS-P11 dài 605 và 775 nucleotit. Đối với plasmit của dòng ban đầu pUC118-C71S-P, đoạn xuôi chiều đã đọc đợc là 619 nucleotit và đoạn ngợc chiều dài 658 nucleotit. Sơ đồ quá trình đọc trình tự các plasmit tái tổ hợp có gắn các đoạn hợp thành C71S-P và kết quả đợc trình bày trên hình 3.10.
Rõ ràng, các đoạn ADN chúng tôi đọc đợc đã bao trùm toàn bộ chiều dài của C71S-P và một số đoạn ADN đã đợc đọc lặp lại. Sau khi ghép các đoạn trình tự đã đọc và xử lý qua chơng trình PC GENE, chúng tôi đã nhận đợc trình tự của C71S- P hoàn chỉnh.
Sau đó, chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự toàn bộ đoạn C71S-P dài 1954 bp với trình tự của Rsuc1-P đã công bố tại các ngân hàng EMBL/ GENBANK/ DDBJ []. Kết quả so sánh đợc trình bày trên hình 3.11.
Từ các phân tích trên, chúng tôi đã phát hiện thấy một điểm đáng chú ý là C71S-P có thêm một đoạn chèn vào phía trên của đoạn khởi động với trình tự dài 13 nucleotit (vị trí từ -1681 đến -1669 trên hình 3.11). Thông thờng các đoạn trình tự nằm ở vùng đầu này là những vùng tăng cờng, có ảnh hởng đến quá trình biển hiện gen. Do vậy, đoạn trình tự chèn vào C71S-P có thể đóng vai trò nhất định trong quá trình điều khiển gen biểu hiện. Ngoài ra, trên toàn bộ chiều dài 1954 bp, chúng tôi còn quan sát thấy 14 vị trí nucleotit khác nhau giữa 2 trình tự này. Các vị trí khác biệt này đợc chúng tôi thống kê trên bảng 3.10.
Rsuc1-P - ATCTGATGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACCAGATCCTGAAATCCACCAAATCAAACCGTGAGATTTTTGCAGAG -75 ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - ATCTGATGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACCGGATCCTGAAATCCACCAAATCAAACCGTGAGATTTTTGCAGAG -75
-1982
Rsuc1-P - GCAAAACAAGAAAAGCATCTGCTTTATTTCTCTCTTGCTTTCTTTTCATCCCCAACCAGTCCTTTTTTCTTCTGT -150
Hình 3.10. Sơ đồ đọc trình tự các đoạn ADN của đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71
||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - ACAAAACAAGAAAAGCATCTGCTTTATTTCCCTCTTGCTTTCTTTTCATCCCCAACCAGTCCTTTTTTCTTCTGT -150 C71S-P - ACAAAACAAGAAAAGCATCTGCTTTATTTCCCTCTTGCTTTCTTTTCATCCCCAACCAGTCCTTTTTTCTTCTGT -150
-1876 -1846
Pst I Hind III
Rsuc1-P - TTATTTGTAGAAGTCTACCACCTGCAGTCTATTATTCTACAGAGAAAAAGATTGAA G CTT TTTTTCTCCAAAGCT -225 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| C71S-P - TTATTTGTAGAAGTCTACCACCTGCAGTCTATTATTCTACAGAGAAAAAGATTGAACCTTTTTTTCTCCAAAGCT -225
-1745
Rsuc1-P - GACAATGGTGCCGGCATATGCTAATAGGATACTCCCTTCGTCTAG---GAAAAAACCAACCCACT -287 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| C71S-P - GACAATGGTGCCGGCATATGCTAATAGGATACTCCCTTCGTCTAGTCCCTTCGTCTAGGAAAAAACCAACCCACT -300 -1681...-1669
Rsuc1-P - ACAATTTTGAATATATATTTATTCAGATTTGTTATGCTTCCTACTCCTTCTCAGGTATGGTGAGATATTTCATAG -362 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| C71S-P - ACAATTTTGAATATATATTTATTCAGATTTGTTATGCTTCCTACTCCTTCTCAGTTATGGTGAGATATTTCATAG -375 -1597
Rsuc1-P - TATAATGAATTTGGACATATATTTGTCCAAATTCATCGCATTATGAAATGTCTCGTTCGATCTATGTTGTTATAT -437 |||||||| ||| |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||| C71S-P - TATAATGACTTTCGACATATATTTGCCCAAATTCATCGCATTATGAAATGTCTCGTTCGATCTAGGTTGTTATAT -450 -1568 -1564 -1551 -1512
Rsuc1-P - TAT-AGACGGAGATAGTAGATTCGGTTATTTTTGGACAGAGAAAGTACTCGCCTGTGCTAGTGACATGATTAGTG -511 ||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TATGAGACGGAGAGAGTAGATTCGGTTATTTTTGGACAGAGAAAGTACTCGCCTGTGCTAGTGACATGATTAGTG -525 -1498 -1488 Rsuc1-P - ACACCATCAGATTAAAAAAACATATGTTTTGATTAAAAAAATGGGGAATTTGGGGGGAGCAATAATTTGGGGTTA -586 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - ACACCATCAGATTAAAAAAACATATGTTTTGATTAAAAAAATGGGGAATTTGGGGGGAGCAATAATTTGGGGTTA -600 Hộp CAAT
Rsuc1-P - TCCATTGCTGTTTCATCATGTCAGCTGAAAGGCCCTACCACTAAACCAATATCTGTACTATTCTACCACCTATCA -661 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TCCATTGCTGTTTCATCATGTCAGCTGAAAGGCCCTACCACTAAACCAATATCTGTACTATTCTACCACCTATCA -675
EcoR I Hộp ASL Hộp TATA
Rsuc1-P - GAATTCAGAGCACTGGGGTTTTGCAACTATTTATTGGTCCTTCTGGATCTCGGAGAAACCCTCCATTCGTTTGCT -736 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GAATTCAGAGCACTGGGGTTTTGCAACTATTTATTGGTCCTTCTGGATCTCGGAGAAACCCTCCATTCGTTTGCT -750 -1267...-1252-1249..-1242 Rsuc1-P - CGTCTCTGACCACCATTGGGTATGTTGCTTCCATTGCCAAACTGTTCCCTTTTACCCATAGGCTGATTGATCTTG -811 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - CGTCTCTGACCACCATTGGGTATGTTGCTTCCATTGCCAAACTGTTCCCTTTTACCCATAGGCTGATTGATCTTG -825 Rsuc1-P - GCTGTGTGATTTTTTGCTTGGGTTTTTGAGCTGATTCAGCGGCGCTTGCAGCCTCTTGATCGTGGTCTTGGCTCG -886 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GCTGTGTGATTTTTTGCTTGGGTTTTTGAGCTGATTCAGCGGCGCTTGCAGCCTCTTGATCGTGGTCTTGGCTCG -900 Rsuc1-P - CCCATTTCTTGCGATTCTTTGGTGGGTCGTCAGCTGAATCTTGCAGGAGTTTTTGCTGACATGTTCTTGGGTTTA -961 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - CCCATTTCTTGCGATTCTTTGGTGGGTCGTCAGCTGAATCTTGCAGGAGTTTTTGCTGACATGTTCTTGGGTTTA -975 Pst I
Rsuc1-P - CTGCTTTCGGTAAATCTGAACCAAGAGGGGGGTTTCTGCTGCAGTTTAGTGGGTTTACTATGAGCGGATTCGGGG -1036 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - CTGCTTTCGGTAAATCTGAACCAAGAGGGGGGTTTCTGCTGCAGTTTAGTGGGTTTACTATGAGCGGATTCGGGG -1050
Hộp II
Rsuc1-P - TTTCGAGGAAAACCGGCAAAAAACCTCAAATCCTCGACCTTTAGTTTTGCTGCCACGTTGCTCCGCCCCATTGCA -1111 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TTTCGAGGAAAACCGGCAAAAAACCTCAAATCCTCGACCTTTAGTTTTGCTGCCACGTTGCTCCGCCCCATTGCA -1125 -849... Rsuc1-P - GAGTTCTTTTTGCCCCCAAATTTTTTTTTACTTGGTGCAGTAAGAATCGCGCCTCAGTGATTTTCTCGACTCGTA -1186 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GAGTTCTTTTTGCCCCCAAATTTTTTTTTACTTGGTGCAGTAAGAATCGCGCCTCAGTGATTTTCTCGACTCGTA -1200 ..-825 Rsuc1-P - GTCCGTTGATACTGTGTCTTGCTTATCACTTGTTCTGCTTAATCTTTTTTGCTTCCTGAGGAATGTCTTGGTGCC -1261 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GTCCGTTGATACTGTGTCTTGCTTATCACTTGTTCTGCTTAATCTTTTTTGCTTCCTGAGGAATGTCTTGGTGCC -1275 Rsuc1-P - TGTCGGTGGATGGCGAACCAAAAATGAAGGGTTTTTTTTTTTTGAACTGAGAAAAATCTTTGGGTTTTTGGTTGG -1336 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TGTCGGTGGATGGCGAACCAAAAATGAAGGGTTTTTTTTTTTTGAACTGAGAAAAATCTTTGGGTTTTTGGTTGG –1350
Rsuc1-P - ATTCTTTCATGGAGTCGCGACCTTCCGTATTCTTCTCTTTGATCTCCCCGTTGCGGATTCATAATATTCGGAACC -1411 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| C71S-P - ATTCTTTCATGGAGTCGCGACCTTCCGTATTCTTCTCTTTGATCTCCCCGTTGCGGATTCATAATATCCGGAACC -1425 -534 Rsuc1-P - TTCATGTTGGCTCTGCTTAATCTGTAGCCAAATCTTCATATCTCCAGGGATCTTTCGCTCTGTCCTATCGGATTT -1486 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TTCATGTTGGCTCTGCTTAATCTGTAGCCAAATCTTCATATCTCCAGGGATCTTTCGCTCTGTCCTATCGGATTT -1500
Rsuc1-P - AGGAATTAGGATCTAACTGGTGCTAATACTAAAGGGTAATTTGGAACCATCCATTATAATTTTGCAAAGTTTGAG -1561 |||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - AGGAATTAGGGTCTAACTGGTGCTAATACTAAAGGGTAATTTGGAACCATCCATTATAATTTTGCAAAGTTTGAG -1575
-441
Hộp GATA
Rsuc1-P - GATATGCCATCGGTATCTCAATGATACTTACTAAAACCCAACAAATCCATTTGATAAAGCTGGTTCTTTTATCCC -1636 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GATATGCCATCGGTATCTCAATGATACTTACTAAAACCCAACAAATCCATTTGATAAAGCTGGTTCTTTTATCCC -1650
-328...-321
Rsuc1-P - TTTGAAAACATTGTCAGAGTATATTGGTTCAGGTTGATTTATTTTGAATCAGTACTCGCACTCTGCTTCGTAAAC -1711 ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TTTGAAAACATTGTCAGAGCATATTGGTTCAGGTTGATTTATTTTGAATCAGTACTCGCACTCTGCTTCGTAAAC -1725 -282 Rsuc1-P - CATAGATGCTTTCAGTTGTGTAGATGAAACAGCTGTTTTTAGTTATGTTTTGATCTTCCAATGCTTTTGTGTGAT -1786 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - CATAGATGCTTTCAGTTGTGTAGATGAAACAGCTGTTTTTAGTTATGTTTTGATCTTCCAATGCTTTTGTGTGAT -1800 Rsuc1-P - GTTATTAGTGTTGATTTAGCATGGCTTTCCTGTTCAGAGATAGTCTTGCAATGCTTAGTGATGGCTGTTGACTAA -1861 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - GTTATTAGTGTTGATTTAGCATGGCTTTCCTGTTCAGAGATAGTCTTGCAATGCTTAGTGATGGCTGTTGACTAA -1875 Rsuc1-P - TTATTCTTGTGCAAGTGAGTGGTTTTGGTACGTGTTGCTAAGTGTAACCTTTCTTTGCAGTTCCTGAAATTGAGT -1936 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| C71S-P - TTATTCTTGTGCAAGTGAGTGGTTTTGGTACGTGTTGCTAAGTGTAACCTTTCTTTGCAGTTCCTGAAATTGAGT -1950 Rsuc1-P – CATG -1940 |||| C71S-P - CATG –1954 -1
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotit và các yếu tố quan trọng trên đoạn khởi động Rsuc1-P và C71S-P
Bảng 3.10. Các vị trí nucleotit khác biệt giữa Rsuc1-P và C71S-P
STT Vị trí
(tính từ mã khởi đầu của C71S-P)
Rsuc1-P C71S-P 1 -282 T C 2 -441 A G 3 -534 T C 4 -1488 T G 5 -1498 - G 6 -1512 T G 7 -1551 T C 8 -1564 G C 9 -1568 A C 10 -1597 G T 11 -1681 … -1669 - TCCCTTCGTCTAG 12 -1745 G C 13 -1846 T C 14 -1876 G A 15 -1982 A G
Trong 14 vị trí nucleotit khác biệt giữa hai đoạn trình tự kể trên, sự khác biệt xảy ra tại vị trí -1745 trên C71S-P (nucleotit C trên C71S-P thay bằng nucleotit G trên Rsuc1-P) đã làm thay đổi trình tự nhận biết của enzym Hind III trên Rsuc1-P. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với thí nghiệm kiểm tra sơ bộ sản phẩm PCR nhân đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 bằng Hind III (chúng tôi đã trình bày ở mục 3.1.2).
Hơn nữa, trong trình tự của C71S-P chúng tôi đã quan sát thấy các trình tự ADN bảo thủ thờng có mặt ở hầu hết các đoạn khởi động nh hộp TATA (trình tự TATA) nằm ở vị trí từ (-1249) đến (-1242), hộp CAAT (trình tự CCAAT) ở vị trí từ (-1306) đến (-1300). Cho tới nay, đối với đoạn khởi động thực vật còn rất ít các nghiên cứu chứng minh vai trò quan trọng của từng yếu tố này []. Tuy nhiên, đột biến các hộp này đã gây ảnh hởng đến hiệu quả quá trình phiên mã ra ARN thông tin. Rõ ràng, các trình tự bảo thủ trên tác động trực tiếp và đóng một vai trò quan trọng trong quá trình biểu hiện gen [].
Đặc biệt, C71S-P còn mang các trình tự đáng chú ý khác nh: hộp ASL nằm ở vị trí từ (-1267) đến (-1252), hộp GATA ở vị trí từ (-328) đến (-321) (bảng 3.11). Về chức năng, các trình tự này đã đợc chứng minh là có liên quan đến biểu hiện gen đặc hiệu bó mạch []. Bảng 3.11 là các trình tự trong C71S-P tơng ứng với các yếu tố điều khiển biểu hiện đặc hiệu bó mạch [], [], [].
Bảng 3.11. Các trình tự trong C71S-P
tơng ứng với các yếu tố điều khiển gen biểu hiện đặc hiệu bó mạch
Yếu tố Trình tự bảo thủ Đoạn khởi động Vị trí trong C71S-P
(tính từ mã khởi đầu)
Hộp ASL GCA(N)6-12GCA
Virut gây bệnh tungro hại lúa (Rice tungro
bacilliform virus); Gen mã hoá sucroza synthaza của cây ngô Sh1; Gen
invCD111 và invCD141
của khoai tây
-1267 . -1252…
Hộp GATA A(N)3GATA
Virut gây bệnh tungro; Gen invCD111 và
invCD141; Gen GSA3 của cây đậu Hà Lan
-328 . -321…
Hộp II CCA…GCCCC Virut gây bệnh tungro -849 . -825…
Rõ ràng, đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 mà chúng tôi phân lập đợc mang đầy đủ những đoạn trình tự bảo thủ có mặt ở hầu hết đoạn khởi động và các đoạn trình tự đã đợc chứng minh là các yếu tố điều khiển gen biểu hiện đặc hiệu bó mạch. Các đoạn khởi động điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu không gian và thời gian nh C71S-P đang đợc rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới tìm kiếm, phân lập, nghiên cứu và đa vào ứng dụng []. Để nghiên cứu sự điều khiển biểu hiện đặc hiệu gen của C71S-P, chúng tôi đã tiến hành thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng dới sự điều khiển của đoạn khởi động này.
3.2 Thiết kế các vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng d- ới sự điều khiển của đoạn khởi động cơ định/ đoạn khởi động đặc hiệu thực vật trong tế bào E. coli
Nhìn chung hiện nay, các nhóm nghiên cứu ở Việt Nam thờng sử dụng các plasmit tái tổ hợp đã đợc thiết kế sẵn để thực hiện các thí nghiệm chuyển gen vào cây trồng [], [], [], [], [], []. Trên cơ sở các nguồn gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng, vấn đề thiết kế vectơ và nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vào tế bào thực vật sử dụng vectơ Ti-plasmit của A. tumefaciens có khả năng thực hiện trong điều kiện Việt Nam. Với các nguyên liệu su tập và phân lập đợc, chúng tôi đã tiến hành thiết kế một số plasmit tái tổ hợp để chuyển vào cây trồng. Sơ đồ thí nghiệm đ- ợc chúng tôi trình bày trên hình 3.12.