hiện diện trong mẫu. Tế bào còn sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.
Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn sẽ làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối, ngược lại số lượng khuẩn lạc quá nhỏ thì lại không có ý nghĩa thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa tùy thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài. Thông thường điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không biểu hiện chính xác số tế bào ban đầu được đưa vào môi trường, nên kết quả đếm và mật độ tế bào được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit) CFU/g thay vì số tb/ml.
Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu.
Quy trình thao tác như sau:
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân - Tạo hộp trải hay hộp đổ
- Ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp
- Đếm khuẩn lạc và tính kết quả. Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính theo công thức sau:
N
A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: n1Vf1 + …+ niVfi
A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng