đem đóng gói trong bao bì kín, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát và tránh ánh sáng trực tiếp.
2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly chất màu từhoa đậu biếc hoa đậu biếc
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin của các hệ dung môi khác nhau, từ đó tìm ra hệ dung môi có khảnăng trích ly tối ưu nhất. Do bột màu sản xuất ra được ứng dụng vào chế biến thực phẩm, đồng thời giúp người sản xuất đơn giản hóa quá trình sản xuất nên đề tài nghiên cứu hướng đến khảo sát những dung môi thường được dùng phổ biến, an toàn và dễ dàng xử lý trong quá trình sản xuất.
Khảo sát dung môi: Nước
Cồn với nồng độ 70o b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc Chuẩn bị dung môi như trên c) Tiến hành thí nghiệm
34
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi thích hợp
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.2, với nhân tốthay đổi là hệ dung môi và 3 lần lặp lại. Tổng số thí nghiệm là 6. Dịch màu sau khi trích ly được để vào các ống nghiệm và quan sát màu qua các khoảng thời gian 6h, 12h,18h. Trên cơ sở này biết được loại dung môi nào giúp bền màu và lựa chọn dung môi thích hợp trong quá trình chiết.
d) Chỉ tiêu theo dõi
Màu của anthocyanin trong mỗi dịch chiết qua các mốc thời gian khác nhau. 2.2.3. Khảo sát sựảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khảnăng trích ly
anthocyanin
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sựảnh hưởng của nồng độ cồn đến khảnăng trích ly anthocyanin, từđó tìm ra nồng độ dung môi có khảnăng trích ly tối ưu nhất.
Khảo sát nhân tố nồng độ ethanol trích ly với nồng độtăng dần từ 40o đến 70o (mỗi giá trị nồng độ khảo sát hơn kém nhau 10o).
Etanol 70o Nước
Lọc
So sánh màu Dung môi thích hợp Ngâm chiết ởđiều kiện thường
và điều kiện nhiệt độ 60oC Hoa đậu biếc
35 b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc Chuẩn bị các nồng độ dung môi c) Tiến hành thí nghiệm
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm chọn nồng độ dung môi thích hợp
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.3, với 1 nhân tố thay đổi là nồng độ dung môi và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm là 15. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết.
40o 50o 60o 70o
Ngâm chiết (bểđiều nhiệt, 60oC)
Lọc Nồng độ etanol thích hợp Thêm etanol với nồng độthay đổi
Hoa đậu biếc
80o
36 d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.4. Khảo sát sựảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từhoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sựđổi màu của anthocyanin trong các môi trường pH khác nhau. Từđó xác định được khoảng pH bền màu anthocyanin.
b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc
Chuẩn bị HCl 10% và NaOH 10% để hiệu chỉnh pH. c) Tiến hành thí nghiệm
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.4, với 1 nhân tố thay đổi là dãy pH (pH từ 1-14). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số thí nghiệm là 15. Quan sát cảm quan bằng mắt, để qua đêm xem màu của anthocyanin bị biến đổi theo dãy pH như thế nào, từđó chọn pH tối ưu nhất có thể làm bền màu anthocyanin.
Hoa đậu biếc Chiết (nhiệt độ phòng, dung môi thích hợp) So sánh màu bằng mắt Quan sát màu, để qua đêm pH thích hợp Lọc Dịch chiết Hiệu chỉnh pH (pH = 1-14)
37 d) Chỉ tiêu theo dõi
Màu của anthocyanin với pH tươngứng.
2.2.5. Khảo sát sựảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khảnăng trích ly a) Mục đích thí nghiệm a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc theo các tỉ lệ của nguyên liệu/ dung môi (hoa đậu biếc/ etanol), từ đó tìm ra tỷ lệ dung môi có khả năng trích ly tối ưu nhất.
Bảng 2.1. Tỷ lệ nguyên liệu/etanol Stt mHoa(g) VEtanol(ml) Tỷ lệ 1 10 50 1:5 2 10 80 1:8 3 10 100 1:10 4 10 120 1:12 5 10 150 1:15 6 10 200 1:20 7 10 250 1:25 b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc
Chuẩn bị dung môi theo tỷ lệnhư bảng 2.1 c) Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.5, với nhân tố thay đổi là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm 21. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết.
38
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp
d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.6. Khảo sát sựảnh hưởng của nhiệt độđến khảnăng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc đậu biếc
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sựảnh hưởng của nhiệt độđến khảnăng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc, từ đó tìm ra nhiệt độ cho khả năng trích ly cao nhất.
1:15
1:05 1:12
Thêm dung môi chiết thích hợp
1:08 Thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:25 1:10 1:20 Ngâm chiết (1h, 60oC) Lọc Dịch chiết Đo độ hấp thụ So sánh hichiết ệu quả Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp Hoa đậu biếc
39
Khảo sát nhân tố nhiệt độ trích ly, với nhiệt độ tăng dần từ 40oC đến 80oC (mỗi giá trị nhiệt độ khảo sát hơn kém nhau 10oC).
b) Chuẩn bị thí nghiệm
Thí nghiệm 6 được tiến hành dựa trên điều kiện tối ưu của các thí nghiệm trên.
Được tiến hành trong bểđiều nhiệt với các giá trị nhiệt độtương ứng. c) Tiến hành thí nghiệm
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ chiết thích hợp
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.6, thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố thay đổi là nhiệt độ. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng nhiệt độ tương ứng. Tổng số thí nghiệm là 15 thí nghiệm. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết.
Đo độ hấp thụ 40oC
Chiết
(dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, phương pháp chiết thích hợp) 70oC Nhiệt độ chiết Dịch chiết Lọc 80oC 50oC 60oC So sánh hiệu suất chiết Nhiệt độ chiết thích hợp Hoa đậu biếc
40 d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từhoa đậu biếc hoa đậu biếc
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin, từ đó tìm ra thời gian cho khảnăng trích ly cao nhất.
Khảo sát nhân tố thời gian của quá trình trích ly với khoảng thời gian khảo sát từ 1 giờ đến 5 giờ (mỗi giá trị thời gian khảo sát hơn kém nhau 1 giờ).
b) Chuẩn bị thí nghiệm
Thí nghiệm 7 được tiến hành dựa trên cơ sở các điều kiện tối ưu của 6 thí nghiệm trên.
c) Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.7, với 1 nhân tố thay đổi là thời gian trích ly. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng thời gian tương ứng, tổng số thí nghiệm là 15 thí nghiệm. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết.
41
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết thích hợp
d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trích ly anthocyanin anthocyanin
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin theo hai phương pháp: ngâm chiết và shoxhlet. Từđó chọn ra phương pháp chiết tối ưu nhất.
b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị nguyên liệu, dung môi Hoa đậu biếc
1h
Chiết
(dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, phương pháp chiết và nhiệt độ thích hợp)
So sánh hiệu suất chiết Đo độ hấp thụ 2h Thời gian chiết Lọc Thời gian chiết thích hợp Dịch chiết 3h 4h 5h
42 c) Tiến hành thí nghiệm
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết thích hợp
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.8, với nhân tố thay đổi là phương pháp chiết và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm là 6. Dịch màu sau khi trích ly được đo độ hấp thụ để chọn loại nguyên liệu phù hợp.
d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.9. Khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc hoa đậu biếc
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sựảnh hưởng của số lần chiết đến khảnăng trích ly anthocyanin. b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc.
Thí nghiệm này được thực hiện dựa vào điều kiện thời gian tối ưu ở thí nghiệm trên.
Ngâm chiết (bểđiều nhiệt, 60oC) Shoxhlet Lọc Dịch chiết Đo độ hấp thụ So sánh hichiếệt u suất Phương pháp chiết thích hợp Hoa đậu biếc
43 c) Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.9, với 1 nhân tố thay đổi là số lần chiết.
Điều kiện chiết:
- Lần 1: nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thời gian chiết theo giá trịxác định ở các thí nghiệm trên
- Lần 2, lần 3: Sau chiết lần 1, lọc lấy dịch sau đó cho dung môi vào phần bã chiết tiếp. Điều kiện nhiệt độ theo giá trị xác định ở thí nghiệm trên, thời gian và lượng dung môi giảm một nửa. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tổng số thí nghiệm là 12. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết để chọn số lần chiết tối ưu nhất.
Hình 2.9. Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết thích hợp
d) Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. Hoa đậu biếc
Lọc Số lần chiết
Chiết
(các điều kiện chiết tối ưu)
1 lần 2 lần 3 lần Đo độ hấp thụ So sánh hiệu suất chiết Số lần chiết thích hợp Dịch chiết tổng
44
2.2.10. Khảo sát sự ảnh hưởng hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột hoa đậu biếc sau khi sấy phun hoa đậu biếc sau khi sấy phun
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát các yếu tố khi sấy phun để chọn điều kiện tối ưu nhất cho ra lượng bột chất lượng nhất.
b) Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu cao của dịch chiết.
Maltodextrin để làm chất mang khi sấy phun. c) Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành sau khi xác định được các điều kiện chiết tối ưu. Trong đó có 3 yếu tố cần khảo sát là khối lượng cao, tỉ lệ phần trăm maltodextrin và lượng nước pha loãng cao. Giữ nguyên khối lượng cao, lượng nước pha loãng và thay đổi lượng maltodextrin xem màu của bột sau khi sấy thay đổi như thế nào.
Sấy phun 3 mẫu, mỗi mẫu lấy 13ml cao ở dạng sệt cho vào 500ml nước. Lượng maltodextrin thay đổi lần lượt của mỗi mẫu là 20g, 25g, 30g. tương ứng với 4%, 5%, 6% của dung dịch sấy phun.
d) Chỉ số theo dõi Độẩm của bột.
Màu và độ mịn của bột.
2.2.11. Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun của hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm thực phẩm
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát màu của 1 số loại thực phẩm sau khi phối trộn bột hoa đậu biếc vào. Từđó chọn tỉ lệ phối trộn thích hợp.
b) Chuẩn bị thí nghiệm
45 c) Tiến hành theo dõi
Phối trộn bột vào khi nấu theo nhiều tỉ lệ khác nhau. Số gam của bột vẫn giữ nguyên, thay đổi số gam nguyên liệu của món ăn. Sau đó chọn tỉ lệ phối trộn cho ra màu đẹp nhất và có lợi nhất.
d) Chỉ tiêu theo dõi
Màu của thực phẩm đã được ứng dụng bột hoa đậu biếc.
Số lượng của thực phẩm được ứng dụng với số gam bột tương ứng.
2.2.12. Khảo sát sự ảnh hưởng của bột và cao hoa đậu biếc đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm
a) Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sự ảnh hưởng của bột hoa đậu biếc đến một số vi sinh vật thường được dùng bổ sung vào thực phẩm như Saccharomyces cerevisiae, Lactobacilus, … từ đó khuyến cáo đến người dùng khi sử dụng bột màu cho một số loại thực phẩm có chứa vi sinh vật đó.
b) Chuẩn bị thí nghiệm Chuẩn bị mẫu bột và cao.
Chuẩn bị 1 số loại vi sinh vật như: lactic, nấm men và môi trường nuôi cấy. c) Tiến hành thí nghiệm
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng của đĩa thạch, sau khi chúng phát triển mạnh cho vào môi trường TSB trong ống nghiệm. Khoảng 12-14h, sau đó khi ống nghiệm đục đem ly tâm lấy phần đục rồi pha loãng với nước cất vô trùng đến độ đục thích hợp. Sau đó, cấy trang lên đĩa thạch với môi trường dinh dưỡng thích hợp của từng vi sinh vật. Gắn giấy kháng khuẩn sau khi đã nhúng vào cao và dung dịch bột hoa đậu biếc với các nồng độ pha loãng. Đọc kết quả sau 12- 14 giờ.
d) Chỉ tiêu theo dõi
46
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu em đã sử dụng các phương pháp: 2.3.1. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu
Hoa đậu biếc tươi sau khi thu mua được đem ngay về phòng thí nghiệm, rửa nhẹ cho sạch, để ráo. Sau đó đem sấy ở nhiệt độ 55oC đến độ ẩm 5-6%, cắt nhỏ 2-3mm và bảo quản trong túi kín để dùng cho các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp định tính thành phần cao
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid Thuốc thử Liebermann – Burchard:
Anhidrid acetic 1 ml H2SO4 đậm đặc
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.
Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch alcol cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào ống nghiệm.
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid Thuốc thử Wagner:
I2 1,27g KI 2 g
H2O vừa đủ 100 ml
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid Thuốc thử Flavnoid:
Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính.
47
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base: Thuốc thử:
HCl 0,1N
NaOH 0,1N
Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử. Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa zqsmẫu thử.
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
2.3.3. Phương pháp xác định tính kháng khuẩn
Các bước tiến hành xác định khảnăng kháng khuẩn/kháng nấm của màu: a) Cách pha loãng
Chiết ởđiều kiện tối ưu (chiết khối lượng nhiều để dùng).
Cô quay chân không để thu cao (cô quay đến dạng sệt để có thể lấy ra được) – cho vào cốc/ đĩa đem đi sấy ở nhiệt độ 60-70oC.
Cao chiết: pha loãng bằng dung dịch DMSO 5%.
1g cao chiết + 10 ml DMSO = nồng độ 0,1 g/ml = 100 mg/ml