Trong quá trình nghiên cứu em đã sử dụng các phương pháp: 2.3.1. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu
Hoa đậu biếc tươi sau khi thu mua được đem ngay về phòng thí nghiệm, rửa nhẹ cho sạch, để ráo. Sau đó đem sấy ở nhiệt độ 55oC đến độ ẩm 5-6%, cắt nhỏ 2-3mm và bảo quản trong túi kín để dùng cho các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp định tính thành phần cao
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid Thuốc thử Liebermann – Burchard:
Anhidrid acetic 1 ml H2SO4 đậm đặc
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.
Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch alcol cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào ống nghiệm.
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid Thuốc thử Wagner:
I2 1,27g KI 2 g
H2O vừa đủ 100 ml
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid Thuốc thử Flavnoid:
Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính.
47
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base: Thuốc thử:
HCl 0,1N
NaOH 0,1N
Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử. Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa zqsmẫu thử.
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
2.3.3. Phương pháp xác định tính kháng khuẩn
Các bước tiến hành xác định khảnăng kháng khuẩn/kháng nấm của màu: a) Cách pha loãng
Chiết ởđiều kiện tối ưu (chiết khối lượng nhiều để dùng).
Cô quay chân không để thu cao (cô quay đến dạng sệt để có thể lấy ra được) – cho vào cốc/ đĩa đem đi sấy ở nhiệt độ 60-70oC.
Cao chiết: pha loãng bằng dung dịch DMSO 5%.
1g cao chiết + 10 ml DMSO = nồng độ 0,1 g/ml = 100 mg/ml
Nồng độ dùng thử nghiệm để xác định vòng kháng khuẩn: 100mg/ml, 200 mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 500mg/ml (tùy loại cao), cần khảo sát nhiều để lựa chọn.
b) Chuẩn bị môi trường
48 Môi trường lỏng và đặc cho lactic.
Môi trường MP (môi trường dinh dưỡng – cao thịt peptone – rắn và lỏng). Môi trường TSB, môi trường MHA.
Tất cả dụng cụ dùng cần phải khử trùng bằng autoclave hoặc dùng tủ sấy 1600C, 2 giờ.
Đĩa giấy đường kính 6 mm.
c) Xác định vòng kháng khuẩn/kháng nấm
Bước 1. Tăng sinh VSV từ ống gốc sang môi trường lỏng MP (môi trường dinh dưỡng cao thịt peptone). Thời gian 12-24 giờ, điều kiện nhiệt độ 370C nếu là vi khuẩn. Còn nếu là nấm men thì trong môi trường Hansen lỏng.
Cách tiến hành: hút 1 ml hoặc chọn 1 vài khuẩn lạc khỏe.
Bước 2. Cấy trên môi trường thạch MP hoặc MHA đối với vi khuẩn, còn với nâm men trên môi trường Hansen đặc.
Bước 3. Chọn 2-3 khuẩn lạc đẹp cấy vào môi trường lỏng TSB. Thời gian 12-24h. Còn nấm men chọn vài khuẩn lạc cho vào nước cất đã khử trùng rồi so với ống đục sau đó cấy trang lên môi trường Hansen – cho đĩa như bước 5) (hoặc có thể thửcác bước 4,5 giống vi khuẩn để xem có lên không)
Bước 4. Ly tâm ống VSV của môi trường TSB sau nuôi cấy 24h, bỏ phần nước ở trên, sau đó cho nước cất đã khử trùng vào. So sánh với ống nghiệm này với ống độđục McFarland đã chuẩn bị.
Bước 5. Nếu xác định vòng kháng khuẩn thì hút 100 l cấy trang lên môi trường thạch MHA, để khô, cho đĩa giấy 6mm và nhỏ 10 l dung dịch cao theo nồng độ pha loãng khác nhau. Kháng dương dùng kháng sinh tetracylin hoặc ampicillin hoặc penicillin (đối chứng + với vi khuẩn gram -) nồng độ 10 g/ml, đối với nấm men dùng nystanin. Đối chứng âm là dung dịch DMSO
Bước 6. Sau 12-24 giờđo kết quả vòng kháng khuẩn = D- d (D –đường kính vòng lớn, d –đường kính đĩa giấy).
2.3.4. Phương pháp phân tích cảm quan [5]
Phân tích cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của hoa đậu biếc như màu
49
sắc, hình dạng, mùi và cấu trúc. Phương pháp dựa trên phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp sản phẩm TCVN 3215-79.
Đánh giá cảm quan bột màu hoa đậu biếc ngoài mục đích phân tích sản phẩm theo các tính chất cảm quan vốn có còn bao hàm cả nội dung thị hiếu đối với các tính chất hoặc đối với chính sản phẩm.
Kết quả của một phép thử cảm quan lên sản phẩm bột màu đối với một chỉ tiêu nào đó thường được lượng hóa bằng điểm hay bằng lời đều là kết quả đánh giá chỉ tiêu đó khi đã phân tích sản phẩm để hiểu hết bản chất của từng chỉ tiêu.
Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 5 thành viên: 1. Nguyễn Thị Ngọc Hiền
2. Trương Thị Mỹ Loan 3. Huỳnh Thị Châu Trâm 4. Đoàn ThịTường Oanh 5. Nguyễn Thị Trang Thi
Tất cả thành viên hội đồng đều là sinh viên lớp DH15TP, ngành Công nghệ thực phẩm, đã trải qua môn học vềđánh giá cảm quan thực phẩm nên có kiến thức cơ bản, đáp ứng điều kiện cần thiết để trở thành cảm quan viên.
Cách tiến hành đánh giá:
Chia nhỏ các mẫu sản phẩm ra đĩa, sao cho các đĩa đều nhau. Mã hóa mẫu. sau đó, ghi mã số ký hiệu để nhận biết từng mẫu rồi chuyển cho từng thành viên của hội đồng đánh giá cảm quan. Các cảm quan viên tiến hành đánh giá cảm quan của mẫu theo từng chỉ tiêu quy định trong bảng 2.2 rồi cho điểm vào phiếu kết quả.
- Về cấu trúc: tiến hành đánh giá về độ tơi, độ mịn. Các cảm quan viên tiến hành quan sát bằng mắt và dùng tay ấn để đánh giá độ tơi của sản phẩm.
- Về màu sắc: các cảm quan viên tiến hành quan sát bằng mắt đề đánh giá màu sắc sản phẩm.
50
- Về mùi vị: dùng các giác quan như vị giác, khứu giác, cảm nhận và đánh giá mùi vị sản phẩm.
Trong quá trình đánh giá cảm quan của nhiều mẫu sản phẩm, các cảm quan viên phải được thanh vị bằng nước sau mỗi lần đánh giá mẫu.
Bảng 2. 2. Điểm chất lượng sản phẩm bột màu từhoa đậu biếc
Các chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Điểm số chất lượng Mô tả Trạng thái 1,2
0 Bột màu ướt, vón cục to và nhiều, không tơi 1 Bột vón cục nhiều, không tơi, hơi ướt 2 Bột vón cục vừa, không tơi 3 Bột vón cục ít, không tơi 4 Bột không bị vón cục, không tơi 5 Bột không vón cục, tơi
Vị 0.8
0 Đắng do cháy khi sấy phun nhiệt độ cao
1 Ngăm ngăm đắng do cháy
2 Không có vị rõ ràng 3 Vị ngọt đậm 4 Vịhơi ngọt 5 Vị ngọt thanh Màu sắc 0.8 0 Màu tím đậm 1 Màu tím vừa 2 Màu tím nhạt 3 Màu tím xanh 4 Màu xanh đậm
5 Màu xanh dương
Mùi 1.2
0 Mùi khét
1 Mùi lạ
2 Không có mùi rõ ràng
3 Mùi của maltodextrin
4 Mùi hơi thơm maltodextrin, có mùi hoa đậu biếc
51 2.3.5. Phương pháp cô quay chân không
Mục đích nhằm cô đuổi dung môi, thu cao chiết để thuận tiện cho việc bảo quản mẫu và sấy phun.
Bay hơi chân không giữ vai trò chủ đạo bởi vì trong một hệ kín, áp suất giảm dẫn tới làm giảm nhiệt độ sôi của các thành phần trong nó. Các thành phần trong mẫu dung dịch được cô quay bay hơi để loại bỏ dung môi mong muốn từ mẫu dịch chiết, nó được ứng dụng trong quá trình tách chiết môt hợp chất tự nhiên hay đơn giản chỉ trong một bước của tổng hợp hợp chất hữu cơ. Dung môi hòa tan có thể được loại bỏ nếu nhiệt độkhông vượt quá nhiệt độ cho phép. Nhiệt độ cho phép phụ thuộc vào độ sôi của hợp chất, chất tan và dung môi.
2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp vi sai [1], [3], [4], [6], [8], [10]
Hàm lượng anthocyanin được xác định theo phương pháp pH vi sau và được tính quy theo cyaniding-3-glucoside, vì đây là sang phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên.
Phương pháp pH vi sai dựa vào sự chuyển đổi thành các cấu trúc khác nhau theo pH của các sắc tố anthocyanin và thể hiện rõ qua các phổ hấp thu khác nhau tương ứng. Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4.5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Tất cả phép cácpheps đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ đựợc thực hiện ở bước song 520 nm (là bước song cực đại của anthocyanin đo được) và 700 nm.
Sử dụng hóa chất và thiết bị:
Hóa chất: dung dịch đệm KCl, 0.025M, pH = 1 và dung dịch đệm NaCH3COO.3H2O, 0.4M, pH= 4.5.
Thiết bị: máy đo ph, máy đo quang phổ khả kiến, cuvet thủy tinh, bình định mức 25ml, pipet chia vạch và có các dung tích thích hợp.
Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly theo cyanidin-3-glucoside. add (mg/l) =𝐴.𝑀𝑊.𝐷𝐹.103
𝜀.𝑙
52
add: Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly (mg/l)
A = (Amax– A700nm)pH 1.0 - (Amax– A700nm)pH 4.5 MW = 449.2 g/mol: KLPT cyanidin-3-glucoside DF: Độ pha loãng l: Bề dày cuvet (cm) = 26900: Hệ số hấp thụ phân tử (l.mol-1.cm-1) 2.3.7. Phương pháp xác định hiệu xuất chiết
Dịch chiết thô được đem đi cô đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không và sấy ở nhiệt độ 60oC đến độ ẩm khoảng 4-5%, sau đó đem xác định khối lượng (mchế phẩm). Khối lượng nguyên liệu (mnguyên liệu) cho các thí nghiệm 10g, độ ẩm nguyên liệu khoảng 5-6%. Hiệu suất chiết được tính theo công thức sau:
H(%) = 𝑚𝑐ℎế 𝑝ℎẩ𝑚
𝑚𝑛𝑔𝑢𝑦ê𝑛 𝑙𝑖ệ𝑢x100 2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Tất cả các thí nhiệm đều được lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong báo cáo là trung bình của 3 lần lặp lại.
Microsoft Excel: Thống kê dữ liệu, trong đó có cả thống kê một cách trực quan dựa vào bảng,biểu đồ,dashboard…
Sử dụng phần mềm ANOVA để xử lý số liệu với giá trị độ tin cậy (P) và giá trị độ lệch chuẩn.
53
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố trích ly
3.1.1. Ảnh hưởng của hệdung môi đến khảnăng trích ly anthocyanin từhoa đậu biếc biếc
Trong quá trình trích ly, yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hàm lượng chất cần trích là hệdung môi được sử dụng trong quá trình trích ly. Chính vì vậy mà thí nghiệm đầu tiên của đề tài là nghiên cứu tìm ra hệ dung môi an toàn, có khả năng trích ly được hàm lượng anthocyanin cao nhất từhoa đậu biếc.
Anthocyanin là chất phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Việc lựa chọn dung môi thích hợp khi trích ly sẽ thu được hàm lượng anthocyanin cao nhất.
Kết quảxác định dung môi chiết được trình bày trên các hình 3.1 – hình 3.8.
Hình 3.1. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ 60oC
Hình 3.2. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ 60oC sau 12h
Hình 3.3. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ thường
Hình 3.4. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ thường sau 12h
54 Kết quả trên cho thấy:
Mẫu sử dụng dung môi nước chiết ở nhiệt độthường hay chiết ở nhiệt độ sôi đều bị biến đổi sang màu tím sau 12h -18h. Mẫu chiết bằng dung môi cồn ởhai điều kiện chiết khác nhau vẫn giữ được màu.
Theo tác giả Anna Bakowxka Barczak (2005) chỉ ra rằng, trên gốc aglucon của anthocyanin có mang điện tích dương nên các anthocyanin có khảnăng nhận H+ hoặc OH- nên làm thay đổi màu sắc của anthocyanin, khi tăng nhóm OH- màu của anthocyanin chuyển theo hướng sắc màu xanh. Trên cơ sở này ta có thể giải thích hiện tượng khi triết bằng ethanol thì màu xanh của dung dịch giữ được lâu hơn khi chiết bằng nước là do chất màu anthocyanin đã nhận OH- từ ethanol.
Hình 3.5. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ 60oC Hình 3.6. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ 60oC sau 12h Hình 3.7. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ thường Hình 3.8. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ thường sau 12h
55
Vì vậy, dung môi etanol 70o được sử dụng để trích ly anthocyanin trong các thí nghiệm tiếp theo. Đây là hệ dung môi rẻ tiền, thân thiện với môi trường và tương đối an toàn cho người sử dụng.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc đậu biếc
Chúng ta cần khảo sát yếu tố nồng độ vì ở các nồng độ dung môi khác nhau nó sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất trích ly thu được. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.9 dưới đây.
Bảng 3.1. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với các nồng độ dung môi khác nhau
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độdung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin
20.29 20.30 20.37 20.79 17.77 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 40 50 60 70 80 H iệu su ất ch iết (% ) Nồng độ dung môi (độ)
56
Qua kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.9, ta thấy độ hấp thụ anthocyanin thu được tăng dần theo từng nồng độ dung môi tương ứng và cao nhất tại nồng độ etanol 70o, nhưng sau đó thì giảm xuống nhanh khi tăng nồng độ cồn lên 80o.
Việc hàm lượng anthocyanin tăng dần khi chiết ở nồng độ 40o đến 70o có thể giải thích là do anthocyanin bản chất là chất hữu cơ đa vòng nên việc tăng nồng độ dung môi chiết ảnh hưởng đến việc hóa tan anthocyanin.
Tuy nhiên, anthocyanin cũng là một chất phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực, mà etanol là một chất phân cực yếu. Vì thếkhi ta tăng nồng độ etanol quá cao làm cho tính phân cực của hệ dung môi giảm [9], dẫn đến khảnăng hòa tan anthocyanin thu được sau trích ly cũng giảm theo. Đó là lý do vì sao ban đầu khi ta tăng nồng độ % etanol trong hệthì hàm lượng anthocyanin thu được tăng liên tục và đạt cao nhất tại nồng độ 70o rồi sau đó giảm trong khi nồng độ etanol tiếp tục tăng.
Vì vậy, chúng tôi chọn etanol 70o là nồng độ dung môi thích hợp để chiết anthocyanin.
3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ hoa đậu biếc
Ở từng giá trị pH khác nhau, màu của anthocyanin sẽ thay đổi theo từng giá trịpH tương ứng.
Hình 3.10. Màu sắc anthocyanin của hoa đậu biếc ởmôi trường pH từ 1-14
Kết quảở hình 3.10 cho thấy, ở pH thấp (pH=1 và pH=2) thì màu dịch chiết bền và có màu đỏ, khi tăng lên (pH=3-5) thì các anthocyanin kém bền màu và có màu tím do anthocyanin tồn tại dưới dạng base quinon; khi pH=6-8 thì anthocyanin tồn tại dưới dạng quinondal anhydro nên có màu xanh đậm; khi pH=9-11 thì các anthocyanin có sự chuyển đổi từ xanh đạm sang vàng tạo nên màu xanh lá,
57
anthocyanin có màu vàng và đậm dần ở pH=12-14 vì anthocyanin tồn tại dưới dạng chalcon.
Dịch chiết được cho vào các ống nghiệm, quan sát màu và lựa chọn màu phù hợp. Dải màu từ màu tím đến xanh đậm là màu nhóm mong mong muốn. Kết quả thu được như hình sau.
Hình 3.11. Dãy đổi màu của anthocyanin trong pH (ph = 5÷9)
Từ kết quả của hình 3.10 và hình 3.11 cho thấy: Ở pH = 5 và pH = 6, anthocyanin có màu xanh tím