Các bước tiến hành xác định khảnăng kháng khuẩn/kháng nấm của màu: a) Cách pha loãng
Chiết ởđiều kiện tối ưu (chiết khối lượng nhiều để dùng).
Cô quay chân không để thu cao (cô quay đến dạng sệt để có thể lấy ra được) – cho vào cốc/ đĩa đem đi sấy ở nhiệt độ 60-70oC.
Cao chiết: pha loãng bằng dung dịch DMSO 5%.
1g cao chiết + 10 ml DMSO = nồng độ 0,1 g/ml = 100 mg/ml
Nồng độ dùng thử nghiệm để xác định vòng kháng khuẩn: 100mg/ml, 200 mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 500mg/ml (tùy loại cao), cần khảo sát nhiều để lựa chọn.
b) Chuẩn bị môi trường
48 Môi trường lỏng và đặc cho lactic.
Môi trường MP (môi trường dinh dưỡng – cao thịt peptone – rắn và lỏng). Môi trường TSB, môi trường MHA.
Tất cả dụng cụ dùng cần phải khử trùng bằng autoclave hoặc dùng tủ sấy 1600C, 2 giờ.
Đĩa giấy đường kính 6 mm.
c) Xác định vòng kháng khuẩn/kháng nấm
Bước 1. Tăng sinh VSV từ ống gốc sang môi trường lỏng MP (môi trường dinh dưỡng cao thịt peptone). Thời gian 12-24 giờ, điều kiện nhiệt độ 370C nếu là vi khuẩn. Còn nếu là nấm men thì trong môi trường Hansen lỏng.
Cách tiến hành: hút 1 ml hoặc chọn 1 vài khuẩn lạc khỏe.
Bước 2. Cấy trên môi trường thạch MP hoặc MHA đối với vi khuẩn, còn với nâm men trên môi trường Hansen đặc.
Bước 3. Chọn 2-3 khuẩn lạc đẹp cấy vào môi trường lỏng TSB. Thời gian 12-24h. Còn nấm men chọn vài khuẩn lạc cho vào nước cất đã khử trùng rồi so với ống đục sau đó cấy trang lên môi trường Hansen – cho đĩa như bước 5) (hoặc có thể thửcác bước 4,5 giống vi khuẩn để xem có lên không)
Bước 4. Ly tâm ống VSV của môi trường TSB sau nuôi cấy 24h, bỏ phần nước ở trên, sau đó cho nước cất đã khử trùng vào. So sánh với ống nghiệm này với ống độđục McFarland đã chuẩn bị.
Bước 5. Nếu xác định vòng kháng khuẩn thì hút 100 l cấy trang lên môi trường thạch MHA, để khô, cho đĩa giấy 6mm và nhỏ 10 l dung dịch cao theo nồng độ pha loãng khác nhau. Kháng dương dùng kháng sinh tetracylin hoặc ampicillin hoặc penicillin (đối chứng + với vi khuẩn gram -) nồng độ 10 g/ml, đối với nấm men dùng nystanin. Đối chứng âm là dung dịch DMSO
Bước 6. Sau 12-24 giờđo kết quả vòng kháng khuẩn = D- d (D –đường kính vòng lớn, d –đường kính đĩa giấy).