VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
4.1.2. Kết quả tách dòng gen fcs và giải trình tự
• Kết quả khuếch đại gen fcs bằng phương pháp PCR
Hình 4.4: Kết quả khuếch đại gen fcs ở các dải nhiệt độ gắn mồi
Đường chạy 1, 2, 3, 4: Nhiệt độ gắn mồi ở 57oC,58oC, 59oC, 60oC tương ứng
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Trong 4 dải nhiệt độ gắn mồi, chỉ xuất băng sản phẩm ở nhiệt độ 570 C và 58oC. Trong đó có 1 băng đậm nhất có vị trí gần vạch 2 kb trên thang chuẩn, đây có thể là gen fcs như dự kiến khoảng 1798 bp. Ngoài ra còn xuất hiện thêm một số băng phụ khác, đây có thể là do nhiệt độ gắn mồi chưa tối ưu nên xuất hiện sản phẩm PCR không đặc hiệu. Để hạn chế sự gắn gen không mong muốn, tôi chọn sản phẩm PCR ở nhiệt độ gắn mồi 58oC để tiến hành gắn gen vào vector tách dòng do ở nhiệt độ này ít xuất hiện băng không đặc hiệu như ở nhiệt độ 57o
C.
• Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-fcs bằng điện di so sánh kích thước Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gen fcs và vector pTZ57R/T mở vòng kết quả thu được 7 dòng khuẩn lạc trắng và 5 khuẩn lạc xanh trên đĩa thạch,vtôi lấy 7 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh nuôi trong môi trường LB lỏng thu sinh khối, tách chiết plasmid và kết quả điện di như sau:
M 1 2 3 4
2 kb 1.5 kb 1.5 kb
≈1798 bp bp
Hình 4.5: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs
Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: Plasmid các dòng khuẩn lạc trắng
Đường chạy 8: Plasmid dòng khuẩn lạc xanh
Plasmid các dòng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 đều có vị trí băng cao hơn plamid của khuẩn lạc xanh nhưng cả 7 dòng trên đều có sự chênh lệch về vị trí băng. Điều này chứng tỏ vector đã chứa đoạn chèn, trong đó có thể chứa những sản phẩm PCR không đặc hiệu. Do vậy, tôi tiến hành PCR khuếch đại gen fcs với DNA khuôn là các dòng plasmid trên và cắt đồng thời 2 enzyme EcoRI và BamHI để xác định chính xác dòng nào mang đoạn gen fcs dự kiến.
• Kết quả khuếch đại gen fcs từ các dòng plasmid bằng phương pháp PCR
Hình 4.6: Kết quả PCR khuếch đại gen fcs
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Đường chạy 1→7: Sản phẩm PCR ở các dòng 1→7
1 2 3 4 5 6 7 8
M 1 2 3 4 5 6 7
2 kb 1,5 kb 1,5 kb
Trong các plasmid được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, chỉ có plasmid dòng 4 xuất hiện băng có kích thước nằm khoảng kích thước dự kiến (khoảng 1798 bp). Đây có thể là dòng chứa gen fcs. Ngoài ra, ở dòng 4 còn xuất hiện các băng phía dưới, đây là do nhiệt độ gắn mồi chưa tối ưu nên xuất hiện thêm sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tôi chọn dòng 4 thực hiện phản ứng cắt đồng thời 2 enzyme
EcoRI và BamHI.
• Kết quả chọn lọc các dòng mang vector pTZ-fcs bằng lập bản đồ giới hạn
Hình 4.7: Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme EcoRI và BamHI
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Đường chạy 1: Sản phẩm cắt enzyme dòng 4
Đường chạy 2: plasmid dòng 4
Ở đường chạy 1 xuất hiện 2 băng: băng thứ nhất nằm trong khoảng 2,5 - 3 kb, tương ứng với kích thước vector pTZ57R/T mở vòng khoảng 2,9 kb, băng thứ hai nằm trong khoảng 1,5 - 2 kb tương ứng với kích thước gen fcs khoảng 1798 bp. Dưạ vào những dữ liệu trên tôi kết luận có thể đã gắn được gen fcs dự kiến vào vector tách dòng pTZ57R/T.
• Kết quả giải trình tự gen fcs
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa có kết quả giải trình tự gen fcs 1 2 M
3 kb 2 kb 2 kb 1.5 kb