P. fluorescens BF13 ** (Calisti et al.2008) ** : tác giả không công bố
2.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giớ
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất vanillin từ các chủng E. coli tái tổ hợp .
Năm 2003, Converti và cộng sự đã đề xuất chủng E. coli tái tổ hợp JM109 mang plasmid pBB1 bao gồm các gen trao đổi chất acid ferulic từ Pseudomonas
fluorescens BF13. Plasmid tái tổ hợp pBB1 được tạo ra bằng việc tạo dòng một đoạn 5098 bp chứa gen ech và fcs từ chủng P. fluorescens BF13 đột biến gen vdh dưới sự điều khiển của promoter chủ Pfer vào vector có số bản copy thấp pJB3Tc19. Các tế bào E. coli chủng JM109/pBB1 được sử dụng cho cho sự chuyển hóa sinh học acid ferulic tới vanillin với năng suất 0.851 mol/l (Torre et al., 2004).
Hình 2.13: Cấu trúc plasmid pBB1 chứa gen từ Pseudomonas fluorescens BF13
(Converti et al., 2010)
Barghini và cộng sự đã báo cáo rằng sử dụng các plasmid có số bản sao thấp sẽ khắc phục sự giảm nhanh chóng sản phẩm cuối trong chủng E. coli tái tổ hợp do tính không ổn định di truyền của đột biến sản xuất vanillin. Các tế bào E. coli
JM109/pBB1 với plasmid có số bản copy thấp dẫn đến nồng độ cuối cùng của vanillin là 3.5 mM sau 6 giờ nuôi cấy với sự cảm ứng của acid ferulic 1.1 mM. Các tác giả còn chỉ ra việc tái sử dụng thành công các tế bào đó trong bốn chu kì chuyển hóa sinh học tiếp theo, điều đó cho phép tăng nồng độ sản phẩm cuối cùng lên 2.52 g vanillin trên mỗi lít dịch nuôi cấy. Sự tái sử dụng sinh khối có thể là một chiến lược thích hợp vừa để củng cố năng suất bằng hệ thống lên men liên tục vừa làm giảm chi phí thu hồi vanillin bằng sự cô đặc sản phẩm cuối trong môi trường (Barghini, Di Gioia, Fava, & Ruzzi, 2007).
Để khai thác một chủng tái tổ hợp ổn định hơn, E. coli JM109 được thiết kế bởi sự tách dòng gen ech và fcs từ Pseudomonas fluorescens BF13 vào một vector (pFR12) với một đơn vị sao chép cảm nhiệt, được thiết kế cho sự hợp nhất gen vào
locus lacZ trên nhiễm sắc thể của E. coli. Chủng được tạo ra mang tên FR13, đã được xác nhận là hiệu quả và ổn định hơn trong sản xuất vanillin so với những chủng biểu hiện cùng các gen đó từ một vector plasmid có sổ bản copy thấp (Luziatelli & Ruzzi).
Một chủng E. coli tái tổ hợp XL1-Blue (pSKech/Hfcs) chứa một plasmid gắn
gen fcs và ech từ Pseudomonas sp.HR199 dưới sự điều khiển of promoter lacZ có
thể chuyển acid ferulic thành vanillin ở mức độ mM (Overhage, Steinbuchel, &
Priefert, 2003).
Tương tự như vậy, gen fcs và ech phân lập từ xạ khuẩn Amycolatopsis sp. strain HR167 được biểu hiện trong chủng E. coli tái tổ hợp cũng có khả năng chuyển đổi acid ferulic thành vanillin (Achterholt, Priefert, & Steinbüchel, 2000).
Hai plasmid tái tổ hợp mang tên pDAHEF và pDDAEF mang gen fcs và ech từ 2 chủng tương tứng Amycolatopsis sp. strain HR104 và Delftia acidovorans được biến nạp vào E. coli. Theo như báo cáo của tác giả, trong cùng một điều điều kiện lên men thì chủng mang plasmid pDAHEF thu được 160 mg/l vanillin trong khi đó chủng còn lại chỉ thu được 10 mg/l. Sự tối ưu hoá quá trình lên men E. coli mang pDAHEF đã được thực hiện bởi sự bổ sung arabinose 13.3 mM như một chất cảm ứng trao đổi chất và acid ferulic 0.2% trong 18 giờ nuôi cấy, kết quả thu được là 580 mg/l vanillin được tạo ra (S.-H. Yoon et al., 2005).
Cũng trong một nghiên cứu song song, Yoon và cộng sự báo cáo rằng vanillin được thu với hiệu suất cao hơn từ chủng E. coli tái tổ hợp thiết kế bởi tách
dòng gen fcs và ech từ Amycolatopsis sp. HR104 dưới sự điều khiển của promoter trc (được cảm ứng bởi IPTG). Nồng độ vanillin thu được là 1,1 g/L trong điều kiện 48h nuôi cấy, môi trường 2YT với acid ferulic 0.2%, không IPTG và không bổ sung nguồn cacbon (S. H. Yoon et al., 2005).
Để củng cố sự sản suất vanillin bằng cách giảm độc tính của nó đối với các tế bào nuôi cấy, có hai chiến lược được đề xuất. Đó là tạo ra một đột biến kháng vanillin mang tên NTG-VR1 bằng phát sinh đột biến nitrosoguanidine và loại bỏ vanillin ra khỏi môi trường bằng nhựa hấp phụ XAD-2. Sử dụng 5 g/L acid ferulic, vanillin thu được với đột biến NTG-VR1 tăng gấp 3 lần so với chủng hoang dại. Kết hợp thêm 50% (w/v) nhựa XAD-2 vào môi trường nuôi cấy, từ 10g/L acid
ferulic thu được 2.9 g/L vanillin. Nồng độ sản phẩm cuối cùng cao hơn 2 lần so với không bổ sung nhựa hấp phụ (Yoon et al., 2007)
Năm 2009, Lee và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất vanillin trên chủng E.coli DH5α (pTAHEF-gltA) với sự khuếch đại gen gltA (mã hóa enzyme citrate synthase cần cho sự chuyển đổi của acetyl-CoA), gen ech và fcs được tách dòng từ
Amycolaptosis sp. strain HR104. Từ 3 g/L acid ferulic tạo ra 1.98 g/L vanillin trong 48 giờ nuôi cấy. Trong cùng nghiên cứu đó, các tác giả chỉ ra sự xóa bỏ gen icdA mã hóa enzyme isocitrate dehydrogenase của chu trình TCA làm tăng cường chuyển hóa acetyl-coA thành CoA khi so sánh với toàn bộ chu trình TCA. Sự sản xuất vanillin bởi chủng đột biến mới E. coli BW25113 mang plasmid pTAHEF cùng với
gen icdA bị xóa bỏ được tăng cường 2.6 lần. Ảnh hưởng điều phối thực sự của việc
khuếch đại gen gltA và sự xóa bỏ gen icdA được quan sát với việc bổ sung nhựa XAD-2 làm giảm tính độc của vanillin. Kết quả là 5.14 g/L vanillin được thu hồi trong 24h nuôi cấy với hiệu suất chuyển đổi 86.6% (Lee et al., 2009).
Trong phạm vi điều hướng trao đổi chất của E. coli cho sản xuất vanillin, các gen chịu trách nhiệm cho sự phân hủy eugenol và isoeugenol đã được phân lập và tách dòng trong các vật chủ tái tổ hợp.
Năm 2003, Overhage và cộng sự đề xuất một quá trình gồm hai bước cho sự chuyển hóa sinh học từ eugenol thành vanillin bằng hai chủng E. coli điều hướng trao đổi chất. Trong bước thứ nhất, eugenol được chuyển tới 8.6 g/L acid ferulic trong 15 giờ bởi E.coli XL1-Blue(pSKvaomPcalAmcalB). Chủng này mang một
plasmid lai(pSKvaomPcalAmcalB) được cấu trúc bởi gen vaoA được tách dòng từ Penicillium simplicissimum CBS 170.90 dưới sự điều khiển của promoter lac cùng với gen calA và calB từ Pseudomonas sp. strain HR199. Trong bước thứ hai, acid ferulic được chuyển hóa thành vanillin bởi chủng E. coli XL1-Blue(pSKechE/Hfcs). Kết thúc quá trình này thu được 0.3 g/L vanillin, 0.1 g/L vanillyl alcohol và 4.6 g/L acid ferulic.
Chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp được tạo ra bằng đưa một plasmid chứa gen mã hóa enzyme isoeugenol monooxygenase của Pseudomonas putida IE27 dưới sự điều khiển của promoter T7. Kết quả nuôi cấy cho thấy 28.3 g/L
vanillin được tạo ra từ isoeugenol 230 mM với hiệu suất chuyển đổi phân tử 81% sau 6 giờ nuôi cấy ở 20o
C (Yamada, Okada, Yoshida, & Nagasawa, 2008).