2.3.3.1. Sử dụng enzyme
Những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia tạo cơ sở cho việc thiết lập một hệ thống enzyme in vitro để sản xuất vanillin.
Dignum và cộng sự đã mô tả việc sử dụng chế phẩm enzyme chứa ß- glucosidase xúc tác phản ứng thủy phân vanillin từ glucovanillin để thu được vanillin giải phóng từ vỏ quả vanila như một sự thay thế quá trình ủ truyền thống, rút ngắn thời gian (Dignum, Kerler, & Verpoorte, 2001).
Ngoài enzyme trên còn có một số enzyme khác được sử dụng để tạo ra vanillin từ các nguyên liệu thực vật khác bằng các biến đổi sinh học. Năm 1989, Kamoda và cộng sự đã sử dụng enzyme lignostilbene αβ-dioxygenase được thu nhận từ Pseudomonas sp. TMY1009 xúc tác sự oxi hóa giải phóng vanillin từ Xtinben tìm thấy phổ biến trong vỏ gỗ (Kamoda, Habu, Samejima, & Yoshimoto, 1989).
Các enzyme được tạo ra bởi tách dòng gen mã hóa enzyme lipoxygenase từ đậu tương đã được biểu hiện trong một số vi sinh vật biến đổi gen để thăm dò khả năng tổng hợp vanillin từ este của coniferyl alcohol (Markus, Peters, & Roos, 1994).
Vanillin còn được giải phóng từ creosol (một thành phần chính của creosote được thu từ xử lí nhiệt gỗ hoặc than đá) và vanillylamine (được thu bởi quá trình thủy phân capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu). Năm 2001, Van den Huevel và cộng sự sử dụng enzyme vanillyl alcohol oxidase (VAO), một flavoenzyme đặc trưng của Penicillium biến đổi cả creosol và vanillylamine thành vanillin với hiệu suất cao. Sự chuyển đổi trung gian VAO của creosol trải qua một quá trình gồm hai bước trong đó ban đầu là sự hình thành vanillyl alcohol sau đó bị oxi hóa thành vanillin. Tuy nhiên creosol không thể được xem như một cơ chất tự nhiên bởi vì có sự biến đổi hóa học mạnh của gỗ hoặc than đá (van den Heuvel, Fraaije, Laane, & van Berkel, 2001).
Có một số nghiên cứu khám phá ra khả năng trao đổi chất ở thực vật để sản xuất chất thơm trong đó có vanillin trong nuôi cấy mô tế bào như lá và cuống lá cuả
Vanilla planifolia. Chiến lược nuôi cấy mô tế bào bao gồm dinh dưỡng cuả cơ chất, sử dụng hoormon ức chế các con đường cạnh tranh, cố định tế bào, điều chỉnh điều kiện môi trường và sử dụng chất hấp phụ như than hoạt tính, nhựa để thu hồi vanillin được tạo ra (Walton et al., 2003).
Năm 1991, Knuth và Sahai đã phát hiện rằng bản chất và nồng độ của các cơ chất được thêm vào môi trường là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy V.fragrans. Phenyladenine và acid ferulic cho kết quả ít tăng cường tạo vanillin, trong khi đó thêm vanillyl alcohol lại cho kết quả tăng hàm lượng vanillin (Knuth & Sahai, 1991).
Năm 1993, Westcott và cộng sự đã cải tiến một quy trình sản xuất vanillin tự nhiên từ các rễ khí sinh sử dụng acid ferulic như một chất xúc tác sinh học. Than hoạt tính cũng được sử dụng đóng vai trò như một chất hấp phụ vanillin tạo ra, do vậy có thể giảm thiểu được sự ức chế quá trình xảy ra. Các mô rể khí sinh có thể được dùng lại một vài lần nhưng hoạt tính sẽ giảm qua mỗi lần sử dụng. Nồng độ của vanillin tạo ra cao hơn khoảng 35 lần so với lượng vanillin ban đầu có trong mô rễ khí sinh và chiếm khoảng 40% vanillin có trong quả vanila trưởng thành. Sử dụng rễ khí sinh bổ sung acid ferulic, vanillin tạo ra nhanh hơn tổng hợp bình thường trong quả từ 5 đến 10 lần. Mặc dù đã có nghiên cứu mô tả thành công sự tích lũy vanillin từ nuôi cấy mô tế bào, song năng suất thực tế không đủ để sản xuất thương mại (Westcott, Cheetham, & Barraclough, 1993).
Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy mô tế bào còn gặp phải một số vấn đề như tính không ổn định của tế bào, tỉ lệ sinh trưởng thấp, đòi hỏi điều kiện vô trùng. Do vậy, đó không phải là lý tưởng cho sản xuất vanillin thương mại. Hơn thế nữa, ứng dụng kĩ thuật di truyền trong Vanilla còn là một vấn đề mơ hồ bởi vì còn thiếu những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia (Walton et al., 2003).
2.3.3.3. Lên men vi sinh vật
Vi sinh vật với khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tuân theo di truyền học phân tử là những mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được tuyển chọn cho sản xuất vanillin bởi khả năng sinh trưởng trên các cơ chất như một nguồn cacbon và năng lượng.
Trên thế giới đã có các nghiên cứu về quá trình lên men vi sinh vật sản xuất vanillin từ các cơ chất khác nhau, dưới đây là bảng tóm tắt một số kết quả của các tác giả.
Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất Cơ chất Vi sinh vật Số lượng (g/L) Nguồn tham khảo Eugenol
Pseudomonas sp. TK2102 0.28 (Washisu et al.1993)
Pseudomonas
sp.HR199 0.44 (Overhage et al., 1999)
Pseudomonas resinovorans
SPR1 0.24
(M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh- Esfahani, & Momenbeik, 2011b)
Isoeugenol
Pseudomonas aeruginosa 1.62 (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh- Esfahani, & Momenbeik, 2011c)
Bacillus subtilis B2 0.9 (Shimoni, Ravid, & Shoham, 2000)
Bacillus subtilis HS8 8.1 (Y. Zhang, Xu, Han, Yan, & Ma, 2006)
Pseudomonas putida IE27 16.1 (Yamada, Okada, Yoshida, & Nagasawa, 2007)
Candida galli PG06 0.58 (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh- Esfahani, & Momenbeik, 2011a)
Psychrobacter sp. CSW4 1.28
(Morahem Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2012)
Acid ferulic
Amycolatopsis .sp
(DSM9991 or DSM9992) 11.5 (Rabenhorst & Hopp, 1997)
Streptomyces setonii ATCC
39116 13.9
(Muheim, MÜLLER, Münch, & Wetli, 2012)
P. fluorescens AN103 ** (Martínez-Cuesta, Payne, Hanniffy, Gasson, & Narbad, 2005) Gasson, & Narbad, 2005)