VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
4.1.1. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen ech
• Kết quả khuếch đại gen ech từ cặn tế bào P. fluorescens bằng phương pháp
PCR
Hình 4.1: Kết quả PCR khuếch đại gen ech
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Gen ech có kích thước dự kiến là 860 bp đủ để phân biệt sự sai khác giữa các
thể tái tổ hợp. Sản phẩm PCR thu được 1 băng sáng rõ duy nhất nằm trong khoảng kích thước dự kiến 860 bp, đây có thể là gen ech theo lý thuyết.
• Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng điện di so sánh kích thước Cơ sở: Trong sàng lọc khuẩn lạc trên môi trường LB/Amp/ IPTG/Xgal, khuẩn lạc trắng là dòng chứa vector đã gắn đoạn chèn còn khuẩn lạc xanh là dòng có chứa vector pTZ57R/T tự đóng vòng. Do được gắn thêm đoạn chèn nên những dòng chứa pTZ-E sẽ có vị trí băng plasmid cao hơn so với plasmid từ khuẩn lạc xanh.
1 kb 750 bp 750 bp ≈860 bp
bp
Sau khi gắn gen ech vào vector pTZ57R/T và biến nạp sản phẩm gắn nối vào
E. coli DH5α , kết quả thu được 15 dòng khuẩn lạc trắng và 6 khuẩn lạc xanh, tôi chọn ngẫu nhiên 9 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh nuôi trong môi trường LB lỏng thu sinh khối, tách chiết plasmid và kết quả điện di như sau:
Hình 4.2: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech
Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Plasmid các dòng khuẩn lạc trắng
Đường chạy 10: Plasmid dòng khuẩn lạc xanh
Plasmid các dòng sau khi điện di đều cho 2 băng tương ứng với hai cấu hình dạng siêu xoắn ở dưới và dạng vòng ở trên. Plasmid các dòng 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 cho vị trí băng cao hơn so với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể là những dòng mang
pTZ-ech.
Dòng 3,5 có vị trí băng plasmid tương đương với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể cũng là vector tự đóng vòng, nhưng lại cho khuẩn lạc màu trắng, điều này có thể là do trải Xgal không đều trên đĩa thạch nên ở vị trí đó không có cơ chất để vector tự đóng vòng biểu hiện enzyme β-galactosidase để phân giải thành màu xanh. Tôi chọn dòng 7, 8, 9 để tiến hành bước sàng lọc tiếp theo.
• Kết quả chọn lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng lập bản đồ giới hạn Cơ sở: Ở 2 đầu của gen ech có chứa vị trí nhận biết của enzyme HindIII và
SacI, nếu gen ech đã được gắn vào vector tách dòng thì khi cắt đồng thời 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn tương ứng với gen ech khoảng 860 bp và vector pTZ57R/T mở vòng có kích thước gần 2,9 kb (2886 bp).
A B
Hình 4.3: A-Vector pTZ-ech theo lý thuyết , B- Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn SacI và EcoRI
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Đường chạy 1,2,3: Sản phẩm cắt của dòng pTZ-ech 7,8,9 tương ứng
Đường chạy 4: plasmid pTZ-ech dòng 7
Đường chạy 5: Sản phẩm PCR khuếch đại gen ech
Sản phẩm cắt của 3 dòng đều cho 2 băng: băng phía trên có kích thước gần 3 kb, còn băng phía dưới khoảng 860 bp và có vị trí tương đương với sản phẩm PCR khuếch đại gen ech. Từ kết quả trên tôi kết luận rằng có thể đã gắn được gen ech dự kiến vào vector tách dòng pTZ57R/T.
• Kết quả giải trình tự gen ech
Mục đích giải trình tự gen ech là để xác định trình tự và so sánh gen ech được tách dòng từ chủng P. fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam so với trình tự các gen ech đã được công bố trên ngân hàng gen đồng thời kiểm tra đoạn gen ech được tách dòng có có khả năng biểu hiện hay không.
Tôi chọn plasmid pTZ-ech dòng 7 và 8 để giải trình tự gen ech tại công ty MACROGEN (Hàn Quốc) sử dụng trình tự mồi xuôi, mồi ngược M13pUC trên vector pTZ57R/T để giải trình tự từ hai đầu gen. So sánh kết quả hình ảnh Chromas giữa 2 dòng, nhận thấy tín hiệu giải trình tự ở dòng 7 rõ nét, không bị nhiễu, không bị chồng lên nhau như dòng 8, trình tự gen ech giữa mồi ngược và mồi xuôi ở dòng
M 1 2 3 4 5
7 trùng nhau, trong khi đó ở dòng 8 có sự sai khác 1 nucleotide. Do vậy trình tự gen
ech ở dòng 7 có độ tin cậy hơn so với dòng 8, tôi sử dụng trình tự gen ech dòng 7 để kiểm tra cũng như so sánh với các trình tự gen ech được công bố trên ngân hàng gen. Kết quả giải trình tự gen ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 được trình bày ở hình 1, 2 trong phần phụ lục.
Kết quả giải trình tự gen ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 cho thấy bộ ba mở đầu ATG và bộ ba kết thúc TGA được bảo toàn, kích thước đoạn gen (từ vị trí bộ ba mở đầu và kết thúc) là 831 bp bằng với kích thước gen ech dùng để thiết kế mồi, vị trí cắt của enzyme giới hạn 2 đầu gen được giữ nguyên và không đột biến. Như vậy các vị trí quan trọng thiết kế trong mồi đều được bảo toàn đây là cơ sở đảm bảo cho công việc tiếp theo có thể thành công và gen ech có thể biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.
Kết quả dịch mã gen in silico không xuất hiện stop codon vô nghĩa nào, đảm bảo sự biểu hiện hoàn toàn của gen ech tạo ra enzyme tương ứng trong vi khuẩn E.
coli. Trình tự lý thuyết các amino acid của gen ech sau khi dịch mã được thể hiện ở hình 3 trong phần phụ lục.
• Kết quả so sánh trình tự gen ech với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen NCBI Kết quả so sánh cho thấy, gen ech trong pTZ-ech dòng 7 có độ tương đồng 99% với gen ech của P. fluorescens JCM5963 đã được công bố trên Genbank mã số DQ119298. Tuy nhiên, gen ech này chưa được sử dụng vào biểu hiện trong E.
coli. Tiếp tục so sánh, gen ech trong pTZ-ech dòng 7 có độ tương đồng 92% với
gen ech của P. fluorescens BF13 đã được công bố trên Genbank mã số AJ536325 (hình 4, phụ lục), đây chính là gen ech dựa vào để thiết kế mồi và giữa 2 gen này có sự tương đồng 98.2% về trình tự chuỗi amino acid ( hình 5, phụ lục)
Từ những dữ liệu trên, có thể kết luận gen ech mà tôi giải trình tự có thể là một trình tự gen ech mới được tách dòng từ một chủng Pseudomonas fluorescens được phân lập tại Việt Nam. Về mặt cấu trúc, giữa các chủng này sẽ có những vùng gen giống nhau (vùng bảo thủ) và vùng biến đổi, trong trường hợp này có thể trình tự gen ech mà tôi sử dụng để thiết kế mồi có vùng trình tự ở 2 đầu gen giống với vùng trình tự 2 đầu gen ech mà tôi tách dòng, nên khi thực hiện phản ứng khuếch đại gen ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 vẫn có sản phẩm. Để có kết luận về khả năng enzyme được mã hóa bởi gen ech do tôi thực hiện tách dòng có
thể tham gia vào chuyển hóa acid ferulic tạo ra vanillin, tôi tiếp tục sử dụng gen ech này để thực hiện gắn nối vào vector pET22-G tạo tổ hợp pET22-GE .