VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.4.1. Quy trình thực hiện
Quy trình của từng nội dung được thể hiện dưới các sơ đồ sau:
\
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tách dòng gen ech, fcs từ P. fluorescens VTCC-B-668
Cặn tế bào P. fluorescens
PCR
Gen ech, fcs Vector tách dòng pTZ57R/T
Gắn nối
Sản phẩm gắn nối
Các dòng khuẩn lạc trắng
Các dòng plasmid
Nuôi và tách chiết plasmid Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch
Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn
pTZ-ech/fcs
Giải trình tự gen
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gen * Kiểm tra chiều gắn của gen trên vector biểu hiện
Các gen được gắn theo thứ tự gltA→ech→fcs tương ứng với thứ tự cuả các vị trí cắt giới hạn duy nhất trên vector pET22b(+). Trong đó, gen gltA được gắn trong tổ hợp HindIII→SacI, gen ech được gắn trong tổ hợp SacI→EcoRI, gen fcs
được gắn trong tổ hợp EcoRI-BamHI. Nếu gen gltA bị gắn ngược chiều tức tổ hợp enzyme giới hạn ở 2 đầu của gen gltA là SacI→HindIII, nằm ngược lại so với thiết kế ban đầu trên vector (HindIII→SacI), như thế sẽ làm mất đi vị trí SacI để thực hiện gắn gen ech tiếp theo. Điều này cũng xảy ra tương tự đối khi gắn gen fcs nếu
pTZ-gen Vector biểu hiện
Cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn ở 2 đầu gen và tinh sạch
Gen Vector mở vòng Gắn nối Sản phẩm gắn nối Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Các dòng khuẩn lạc trắng Các dòng plasmid pET22-gen Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn
gen ech bị gắn ngược chiều. Do vậy để đảm bảo hiệu quả gắn nối, tôi tiến hành kiểm tra chiều gắn của từng gen trên vector.
3.4.2. PCR
Vi khuẩn P. fluorescens VTCC-B-668 được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật – Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng, lắc ở 37oC nuôi qua đêm, dịch nuôi cấy được ly tâm thu cặn tế bào. DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại gen ech và fcs sử dụng 2 ul dịch tế
bào P. fluorescens đã pha loãng 10 lần từ cặn tế bào.
Phản ứng tiến hành với thể tích 25 µl, thành phần phản ứng PCR được trình bày dưới bảng 3.5 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR Hóa chất Thể tích PCR Mastermix 2X 12,5 ul DNA khuôn 2 ul Mồi ( F+R) 3 ul H2O 7,5 ul
Trộn đều các thành phần sau đó đặt vào máy PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen ech, fcs được trình bày dưới hình sau:
Hình 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen fcs
Do nhiệt độ nóng chảy (Tm) của 2 mồi dùng để khuếch đại gen fcs có sự chênh lệch, nên chúng tôi tiến hành chạy PCR dải nhiệt độ để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự khuếch đại gen fcs.