2 vị trí nhận biết của enzyme NcoI là 569 bp, nên khi cắt bằng enzyme NcoI sẽ tạo ra hai băng có kích thước khoảng 569 bp và 6,2 kb.
- Trường hợp 2: gltA gắn ngược chiều. Khoảng cách giữa 2 vị trí nhận biết
NcoI là 809 bp, nên khi cắt bằng enzyme NcoI sẽ tạo ra hai băng có kích thước khoảng 809 bp và 6 kb.
Hình 4.11: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI
Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid dòng 1 và 7
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Kết quả điện di hình 4.11 đúng với trường hợp 1. Như vậy, gen gltA được gắn đúng chiều trong vector pET22-G, đảm bảo vị trí enzyme SacI cho phản ứng gắn gen ech tiếp theo.
4.2.2. Kết quả gắn gen ech vào vector pET22-G tạo tổ hợp pET22-GE
• Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng điện di plasmid sàng lọc
kích thước
Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa ech và pET22-G tôi thu được 6 dòng khuẩn lạc. Tách chiết plasmid của 6 dòng này, điện di sàng lọc các dòng có khả năng mang tổ hợp pET22-GE, bằng cách so sánh kích thước với đối chứng pET22- G. Kết quả được thể hiện dưới hình 4.12.
1 2 M
750 bp 500 bp 500 bp ≈569 bp
Hình 4.12: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE
D1→6: Các dòng plasmid khuẩn lạc trắng
Trong các dòng plasmid trên có 5 dòng: dòng 2,3,4,5,6 có vị trí băng cao hơn băng đối chứng là vector pET22-G. Đây có thể là các dòng đã được gắn gen ech vào pET22-G. Plasmid dòng 1 có vị trí băng thấp hơn các plasmid dòng còn lại, đây có thể là do bị nhiễm plasmid lạ trong quá trình thao tác.
• Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng lập bản đồ giới hạn.
Hình 4.13: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng 2 enzyme SacI và
EcoRI
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Đường chạy 1: Sản phẩm cắt vector pET22-G
Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt các dòng 2,3,4,5,6 tương ứng pET22-G D1 D2 D3 D4 D5 D6 1 M 2 3 4 5 6 1 kb 750 bp 6 kb ≈860 bp
Cơ sở: Trên vector pET22-GE có duy nhất 2 vị trí của enzyme EcoRI và SacI nằm ở 2 đầu của gen ech, nên khi cắt đồng thời 2 enzyme này, sẽ tạo ra hai đoạn tương ứng với gen ech (khoảng 860 bp) và đoạn vector pET22 còn lại (khoảng 6,8 kb). Kết quả điện di cho thấy, cắt dòng 2,3,4,5,6 đều cho tạo ra 2 đoạn theo đúng lý thuyết. Trên pET22-GltA, do không gắn gen ech, khoảng cách giữa SacI và
EcoRI là 9 bp nên khi cắt đồng thời 2 enzyme sẽ tạo ra một đoạn có kích thước khoảng 7,6 kb, và một đoạn 9 bp do quá nhỏ nên bị chạy ra khỏi bản gel trong quá trình điện di.
Dựa vào kết quả trên, tôi kết luận đã gắn được gen ech dự kiến vào pET22- G, tạo tổ hợp pET22-GE.
• Kết quả kiểm tra chiều gắn gen ech trên pET22-GE
Cơ sở: Trên pET22-GE, sau vị trí EcoRI của gen ech có một vị trí của
enzyme BamHI. Khi cắt đồng thời bằng hai enzyme là EcoRI và BamHI, có 2 trường
hợp xảy ra:
Hình 4.14: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen ech trong pET22-GE
- Trường hợp 1: gen ech gắn xuôi chiều. Khi đó, vị trí EcoRI nằm gần với vị
trí BamHI của pET22b+ (cách nhau khoảng 12 nucleotide) nên khi cắt pET22-GE
đồng thời bằng 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn gen: Một đoạn kích thước 12 nucleotide, đoạn này kích thước quá nhỏ nên sẽ bị chạy ra khỏi bản gel trong quá trình điện di và một đoạn kích thước khoảng 7,6 kb (7634 bp). Đây là kết quả mong đợi.
- Trường hợp 2: gen ech gắn ngược chiều. Khi đó, khoảng cách từ vị trí
EcoRI và BamHI bằng tổng kích thước gen ech cộng thêm 10 nucleotide, tức là khi cắt đồng thời 2 enzyme đó sẽ tạo ra 2 đoạn: Một đoạn kích thước khoảng 871 bp (tương ứng với gen ech) và một đoạn có kích thước khoảng 6,8 kb (tương ứng với đoạn vector còn lại).
Hình 4.15: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và BamHI
Đường chạy 1: plasmid dòng 2 (pET22-GE2)
Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt EcoRI-BamHI dòng 2,3,4,5,6
Khi cắt các dòng bằng EcoRI và BamHI đều cho 1 băng duy nhất, trong khi plasmid có 3 băng, chứng tỏ enzyme cắt hoàn toàn, kết quả này đúng với trường hợp 1. Như vậy gen ech được gắn cùng chiều trong vector tái tổ hợp pET22-GE, đảm bảo vị trí enzyme EcoRI cho thí nghiệm gắn gen fcs.
4.2.3. Kết quả gắn gen fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF
Do chưa có kết quả giải trình tự gen fcs nên tôi chưa thực hiện được nội dung này.
L 1 2 3 4 5 6
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận