P. fluorescens BF13 ** (Calisti et al.2008) ** : tác giả không công bố
2.4.2. Vi khuẩn E.coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin.
Hiện nay, trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram
âm E. coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất
vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ. Trên thị trường hiện nay thương mại nhiều loại vector tách dòng, vector biểu hiệu và chủng đột biến đối với hệ biểu hiện này. Đồng thời, trong E. coli kiểu dại không có sự tổng hợp vanillin tự nhiên nhưng chúng có thể tiếp nhận các gen ngoại lai để tạo ra vanillin mà không có con đường phân hủy vanillin. Đây là cơ sở để lựa chọn chủng E. coli để làm đối tượng nghiên cứu
Các tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp chứa 2 gen fcs và ech trong điều kiện môi trường có chứa acid ferulic và các chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào diễn ra quá trình tổng hợp vanillin theo sơ đồ ở hình 2.11.
Hình 2.11: Con đường sinh tổng hợp vanillin trong chủng E. coli tái tổ hợp
(S. H. Yoon et al., 2005)
Acid ferulic bị chuyển hóa thành feruloyl-CoA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl-CoA (mã hóa bởi gen fcs) sử dụng ATP và CoA, sau đó feruloyl-CoA cộng nước tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl-CoA và phân
tách tạo ra vanillin và acetyl-CoA dưới sự xúc tác xủa enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase mã hóa bởi gen ech.
Sự tích lũy acety-CoA trong tế bào gây ra hai vấn đề chính: Một là làm giảm nồng độ vanillin tạo ra; hai là gây thiếu CoA cho phản ứng chuyển hóa acid ferulic thành feruloyl-CoA, dẫn đến dư thừa cơ chất có thể gây ức chế phản ứng. Do vậy, cần có quá trình tái sử dụng tối đa lượng acety-CoA dư thừa tạo thành CoA để khắc phục hai vấn đề trên cũng như giảm bới tiêu hao năng lượng, tăng cường chuyển hóa acid ferulic thành vanillin. Quá trình đó đã được Lee và cộng sự (2007) báo cáo liên quan tới một chuỗi các phản ứng trong chu trình TCA và con đường vòng Glyoxylate với sự tham gia của gen gltA (citrate synthase).
Hình 2.12. Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA
(Lee et al., 2009)
Các gen và enzyme tương ứng: fcs: feruloyl-CoA synthetase ech: enoyl-CoA hydratase/aldolase gltA: citrate synthase
iclR: transcription repressor aceA: isocitrate lyase aceB: malate synthase
Gen gltA mã hóa enzyme citrate synthase xúc tác phản ứng đầu tiên của chu
trình TCA nơi có sự tiêu thụ acetyl-CoA giải phóng ra CoA. Sự khuếch đại gen gltA làm tăng cường tiêu thụ acetyl-CoA để tạo ra nhiều CoA từ đó sẽ chuyển hóa tối đa lượng acid ferulic. Ngoài con đường trên thì còn có một con đường nữa để chuyển acetyl-CoA thành CoA đó là con đường vòng glycoxylate nơi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-ketoglutarate. Như vậy, con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng (Lee et al., 2009).
Để thực hiện con đường này cần có sự tham gia của hai enzyme isocitrate lyase và malate synthase mã hóa bởi gen aceA, aceB . Tuy nhiên, sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gen điều hòa iclR. Do vậy để sử dụng tập trung acetyl- CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gen aceA và aceB bằng cách xóa bỏ
gen iclR, đồng thời xóa bỏ gen icdA bởi vì isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenase (icdA) hơn enzyme isocitrate lyase (aceA) .
Gen gltA được xác định nằm trong nhiễm sắc thể của E. coli (Ner et al.,
1983) và đã được tách dòng và giải trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng GenBank số EG10402.
Như vậy để tăng cường hiệu suất sản xuất vanillin trong E. coli cần kết hợp
ba gen fcs, ech, gltA trên cùng một hệ thống vector biểu hiện trong điều kiện nuôi
cấy được tối ưu hóa.