VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
449-739 Gen kháng kháng sinh
enzyme phân giải kháng sinh ampicilin , điều này đồng nghĩa với việc các tế bào mang vector pTZ57R/T có thể sống sót và phát triển trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin.
- Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lac-operon, hệ thống này bao gồm gen LacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase và Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG. Với các tế bào chủ mang vector pTZ57R/T tự đóng vòng hay không có sự gắn xen xảy ra, Lac-operon hoạt động bình thường. Trong môi trường có IPTG, enzyme β-galactosidase được tổng hợp. Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này có màu xanh. Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β-galactosidase không được tổng hợp, không có sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng. Các thành phần của vector pTZ57R/T được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T
Thành phần Vai trò Vị trí
Vị trí đa tách dòng (Multiple cloning site)
Cắt kiểm tra đoạn xen được nhân dòng, phục vụ cho công việc lập thư viện DNA
615-695
LacZα
Chọn lọc, giúp phân biệt các dòng tế bào mang vector có và không có đoạn xen
449-739 Gen kháng kháng sinh Gen kháng kháng sinh
ampicilin (Amp resistant gen)
Chọn lọc, nhằm duy trì các dòng tế bào mang vector pTZ57R/T
1896-2756
Điểm khởi đầu sao chép rep (pMB1)
Chịu trách nhiệm cho sự tái bản của vector pTZ57R/T
trong E. coli
1122-1736
T7 promoter Phiên mã in vitro đoạn chèn
DNA với T7 RNA polymerase 697-716 Phage f1 origin Tổng hợp 1 chuỗi DNA đơn 2-457
Gen gltA (1284 bp), mã hóa cho enzyme citrate synthase, xúc tác cho phản
ứng chuyển đổi acety-CoA thành CoA làm tăng hiệu quả tiêu thụ acid ferulic, được tách dòng từ vi khuẩn E. coli BL21. Ở 2 đầu gen gltA có chứa vị trí cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và SacI. Vector pTZ-gltA đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn E. coli ở thí nghiệm trước đó, được sử dụng làm vật liệu cung cấp gen
gltA.
-
Hình 3.2: Cấu trúc vector pTZ-gltA
Vector pET22b(+)
Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các gen
gltA, ech, fcs từ chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668
Hình 3.3. Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+)
Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b(+)
Thành phần Vị trí
T7 promoter 361-377
T7 transcription start 360
pelB coding sequence 224-289
Multiple cloning sites (NcoI – XhoI) 158-225
His•Tag coding sequence 140-157
T7 terminator 26-72
lacI coding sequence 764-1843
pBR322 origin 3277
bla coding sequence 4038-4895
f1 origin 5027-5482
Vector pET22b(+) được thiết kế có vùng đa tách dòng (hình 3.3) với 15 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: AvaI, XhoI, NotI, EagI, HindIII, SacI, EcoRI, BamHI,
NcoI, MscI, BseRI, BspMI, NdeI, XbaI, cho phép gắn các gen quan tâm vào vector và biểu hiện ra sản phẩm mong muốn. Tất cả đều cho một vị trí cắt duy nhất trên vector, đảm bảo việc gắn gen một các đặc hiệu và gen được gắn không bị mắt đi ở những bước cắt, gắn nối tiếp theo. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi quy đinh chiều từ BamHI đến HindIIIlà chiều 5’→3’.
Vector pET22b(+) mang trình tự C-terminal His*tag, thuận lợi cho việc tinh sạch protein, vị trí khởi đầu sao chép tạo ra số bản sao thấp (low copy) trong tế bào E. coli.
Promoter T7 cho phép tế bào kiểm soát chặc chẽ sự biểu hiện của gen thông qua hệ thống gen điều hòa, có khả năng biểu hiện cao khi cảm ứng IPTG.
Gen kháng ampicillin giúp cho vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa kháng sinh, giúp chọn lọc những dòng có mang plasmid mong muốn.
Lý do tôi sử dụng vector pET22b(+) mà không phải vector khác là do pET22b(+) có chứa thêm một trình tự chuỗi tín hiệu N-terminal pelB quy định tiết protein vào khoang chu chất (hay gian bào), điều này có nhiều ưu điểm đó là giảm sự phân cắt protein đích, protein không gây độc cho tế bào, hầu hết protein khi được tiết ra khoang chu chất đều là protein tan, có chức năng sinh học. Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli thường được định hướng vận chuyển đến đây.
3.1.2.2. Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại gen fcs và ech.
Giữa các chủng trong một loài bên cạnh những sai khác nhỏ về hệ gen thì phần lớn có sự tương đồng về trình tự gen. Do vậy để khuếch đại gen ech, fcs từ chủng P. fluorescens VTCC-B-668, tôi sử dụng cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự gen ech của chủng P. fluorescens BF13 đã được công bố trên Genbank với mã số AJ536325.
Bảng 3.3: Trình tự mồi khuếch đại gen ech, fcs
Tên
mồi Trình tự mồi (chiều 5’→3’)
Chiều dài đoạn gen Ban đầu Sau PCR Ech-F aGAATTCAGGAGGgcatcgccATGAGCAACTACGA EcoRI 831 bp 860 bp Ech-R gcGAGCTCTCAGCGTTTATACGCCTGCAG SacI Fcs-F aGGATCCAGGAGGtgctgcacATGCGCTCGCT BamHI 1770 bp 1798 bp Fcs-R aGAATTCTCATGGCTTGGGCTCGGCG EcoRI
AGGAGG: Vị trí bám của ribosome
tgctgcac:Khoảng trống giữa vị trí bám ribosome với bộ ba mở đầu
ATG: Bộ ba codon mở đầu TTA: Bộ ba codon kết thúc
AGCAACTACGA: Trình tự bắt cặp
Trình tự mồi được thiết kế vị trí cắt enzyme giới hạn mỗi đầu tương ứng với mỗi gen để thuận lợi cho quá trình cắt, nối DNA. Ở mồi xuôi bao gồm vị trí bám cuả ribosome, khoảng trống, bộ ba mở đầu, trình tự bắt cặp . Ở mồi ngược bao gồm bộ ba kết thúc và trình tự bắt cặp.
3.1.3. Hoá chất
3.1.3.1. Hoá chất dùng cho gắn nối gen vào vector
- Enzym nối T4 DNA ligase và buffer T4 DNA ligase được cung cấp từ hãng Thermo Scientific
3.1.3.1. Hóa chất tách chiết DNA plasmid
Tách chiết plasmid theo phương pháp “Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS”
- Solution I: Tris HCl 1M pH8, EDTA 0.5M pH8, glucose, H2O khử ion - Solution II: NaOH 3M, SDS 10%
- Solution III: CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử ion 3.1.3.2. Hóa chất dùng trong điện di
- Agarose
- Dung dịch đệm TAE (Tris base, EDTA, NAOH, Acid acetic) - Đệm tra mẫu ( Loading dye 6X)
3.1.3.4. Hoá chất cho phản ứng cắt enzyme giới hạn
- Enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI, HindIII , NcoI và buffer enzyme tương ứng
3.1.3.3. Hoá chất dùng cho phản ứng thôi gel:
Các hóa chất đi kèm bộ Kit tách chiết DNA từ gel: MEGA- spinTM
Agarose Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific
3.1.3.4. Hóa chất cho môi trường nuôi E. coli
- LB lỏng: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khử trùng - LB đặc: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khủ trùng, agar 3.1.3.5. Hoá chất cho chuẩn bị tế bào khả biến
- CaCl2 - Glycerol
3.1.3.6. Hoá chất cho biến nạp và chọn lọc khuẩn lạc - Kháng sinh ampicilin - Xgal - IPTG 3.1.3.7. Hoá chất cho phản ứng PCR - Buffer - MgCl2 20mM - Taq-DNA Polymerase - dNTPs - Nước khử ion 3.1.4. Dụng cụ
Pipet, eppendorf, đầu tip, ống fancol, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy bạc,...
3.1.5. Thiết bị
Bảng 3.4: Danh mục các thiết bị
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK
2 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USD 3 Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall Co.UK 4 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA 5 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan 6 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan 7 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany
8 Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức
9 Tủ lạnh -200C; -800C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 10 Máy votex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China 11 Máy spindown E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA
12 Bể ổn nhiệt Techne – OSI
13 Máy lắc S3000 – Jeotech – Korea
14 Máy PCR Amplied Biosystems USA/ Singapore