VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
4.2.1. Kết quả gắn gen gltA vào pET22b+ tạo tổ hợp pET22-G
Gen gltA (1284 bp), mã hóa cho enzyme citrate synthase, xúc tác cho phản
ứng chuyển đổi acety-CoA thành CoA làm tăng hiệu quả tiêu thụ acid ferulic, được tách dòng từ vi khuẩn E. coli BL21. Ở 2 đầu gen gltA có chứa vị trí cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và SacI. Gen gltA đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn E. coli ở thí nghiệm trước đó, được sử dụng làm vật liệu cung cấp gen gltA.
• Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-G bằng điện di plasmid sàng lọc kích thước Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gen gltA và vector pET22b(+) mở vòng tôi thu được 10 dòng khuẩn lạc. Kết quả tách chiết plasmid và điện di sàng lọc trên gel agarose như hình 4.8.
Hình 4.8: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G
D1→10: Các dòng plasmid khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di cho thấy trong 10 dòng khuẩn lạc, có dòng 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10 xuất hiện băng plasmid có vị trí cao hơn băng đối chứng là vector gốc pET22b(+), đây có thể là vector pET22b(+) đã được gắn gen gltA. Tôi chọn dòng 1, 7 cho bước chọn lọc tiếp theo.
• Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-G bằng lập bản đồ giới hạn
Chọn lọc lần hai với plasmid dòng 1,7 bằng phản ứng cắt đồng thời hai
enzyme HindIII và SacI .
Hình 4.9: Kết quả cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI
Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt dòng 1, 7
Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1 kb
Sau khi cắt đã tạo ra được 2 băng: một băng kích thước khoảng 1284 bp (tương ứng với kích thước gen gltA) và một băng kích thước khoảng 5,5 kb (tương ứng với kích thước cuả vector pET22b+, còn băng mờ phía trên có thể là do phản ứng cắt chưa hoàn toàn. Từ kết quả trên có thể coi đây là vector pET22-G theo lý thuyết.
• Kiểm tra chiều gắn gen gltA trong pET22-G.
Dựa trên cơ sở trên gen gltA có 1 vị trí nhận biết của enzyme NcoI, trên vector pET22 cũng có 1 vị trí cắt của NcoI. Có hai trường hợp xảy ra (hình 4.10):
Hình 4.10: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen gltA trong pET22-G
M 1 2