VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.4.4.Tách chiết DNA plasmid
Để sàng lọc kết quả gắn gen vào vector: Chọn lọc khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB lỏng, có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicilin, nuôi lắc 180 vòng/ phút ở 37oC qua đêm.
Tiến hành tách chiết plasmid dựa trên nguyên lí của việc biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch.
3.4.4.1. Tách chiết plasmid theo phương pháp “Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS” có sửa đổi
Các bước tiến hành:
- Bước 1: Thu cặn tế bào
+ Hút 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf
+ Ly tâm 5000 vòng/phút trong vòng 5 phút, loại dịch, thu cặn tế bào + Bổ sung thêm 1,5 ml dịch nuôi cấy ly tâm lần 2
- Bước 2: Phá tế bào và loại trừ protein
+ Bổ sung 150µl dung dịch Sol I, vortex để hòa tan hoàn toàn căn tế bào + Sau đó bổ sung 150µl dung dịch Sol II, đảo nhẹ nhàng 6-8 lần
+ Bổ sung 150µl dung dịch Sol III, đảo nhẹ nhàng
+ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu dịch trong + Thêm 450µl chlorofom: isoaminalcohol tỷ lệ 24:1
+ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút - Bước 3: Tủa DNA plasmid
+ Hút 400µl dịch nổi chuyển sang ống mới
+ Bổ sung 400µl isopropanol giữ ở -20oC trong 3 phút + Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút
- Bước 4: Rửa DNA plasmid
+ Bổ sung 1000 µl ethanol 70% ly tâm 13000 vòng/phút
+ Hòa tan DNA plasmid trong 50 µl H2O + RNAse đảo nhẹ, bảo quản ở -20°C 3.4.4.2. Tách chiết plasmid bằng bộ kit DNA-spin của hãng Thermo Siencetific
- Ly tâm 5000 vòng/ phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào các ống tế bào, vortex đến khi tan hết cặn khuẩn.
- Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 3-4 lần
- Bổ sung 350 µl Neutralization buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút - Hút dịch lỏng sang cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng - Bổ sung 700 µl Washing A buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng
- Ly tâm lần 2 ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn ethanol - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50 µl Elution buffer, đợi ít nhất 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA plasmid.