2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP
2.3.5 Ly trích và định lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nguyên tắc:
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có thể được trích ly nhờ sự dùng dung môi hữu cơ metanol, etanol, acetone, chloroform…và thay đổi pH thích hợp. Sau đó, sự c ô lập các chất này được thực hiện nhờ phương pháp sắc ký.
Hoạt tính của auxin (AIA), cytokinin (zeatin), giberelin (GA3) và Acid abscisic xác định thông qua sinh trắc nghiệm.
Vật liệu:
Vật liệu li trích, hột xà lát, hột dưa chuột.
Hóa chất: Eter etylic, Metanol, Acid acetic, NaHCO3 8%, HCl 1%, NaOH 1%
Phương pháp:
Mẫu hoa + Methanol 80%
Nghiền, ủ 24 giờ, lọc (3 lần) Dịch trích Methanol
80%
Cô cạn Dịch tan trong nước (1ml)
Chỉnh pH 2,5 bằng HCl 1N,
Pha ether Pha nước
Pha ether (dịch trích ở
pha acid) trích ở pha trung tính) Pha n-butanol (dịch
Định lượng auxin, acid
abcisic, gibberelin Định lượng cytokinin
Rửa bằng NaHCO3 8% NNaHCO
Chỉnh pH 7 bằng NaOH 1N Lóng với n-butanol bão hòa (3 lần) Rửa bằng NaHCO3 8%
23
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Ly trích được thực hiện trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút không khí [7].
Định lượng auxin thô bằng phương pháp so màu [15]: Dựng đường tương quan giữa nồng độ IAA (mg/l) và OD530nm
Chuẩn bị 6 ống nghiệm và cho vào mỗi ống các chất theo bảng sau:
Bảng 2.2. Khảo sát sự tương quan giữa OD530nm và nồng độ IAA (mg/l)
Chú thích: ODi : giá trị OD530nm ở nồng độ IAA là i ODo : giá trị ODcủa nước cất.
- Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong vòng 1 giờ. Sau đó đem đi đo OD ở bước sóng 530nm.
- Tính kết quả: ODchuẩn = ODi – ODo
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD530nm và nồng độ IAA.
Định lượng nồng độ IAA trong mẫu :
Tiến hành bổ sung vào ống nghiệm các thành phần sau: - Auxin trích ly được, pha loãng với nước cất: 5ml - Thuốc thử Salkowski : 3ml
Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong 1 giờ để auxin phản ứng với thuốc thử Salkowski. Sau đó đem đo OD ở bước sóng 530nm.
Tính kết quả: OD = ODmẫu - ODo , dựa vào đường tương quan giữa nồng độ IAA chuẩn và giá trị OD530nm , suy ra nồng độ auxin có trong dịch nuôi cấy.
Xác định hoạt tính cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên tử diệp dưa chuột [7].
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l).
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch IAA chuẩn 10mg/l (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0
Nước cất (ml) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 5
Nồng độ IAA (mg/l) 1 2 3 4 5 0
Thuốc thử Salkowski 3 3 3 3 3 3
24
Chọn những hạt dưa chuột có kích thước đều nhau, rửa sạch, ngâm trong 1 giờ. Sau đó đặt hạt vào đĩa petri có lót giấy thấm nước, ủ tối trong vòng 24 giờ.
Khi rễ mầm vừa nhú ra khỏi vỏ hạt khoảng 2-5 mm, lấy ra, lột vỏ cứng và lớp vỏ lụa, tránh làm tổn thương tử diệp.
Dùng giấy thấm quấn quanh lam, đặt vào trong đĩa petri, mỗi đĩa 1 lam.
Cân 5 mảnh tử diệp (sau khi được thấm khô cẩn thận trên giấy thấm) bằng cân phân tích. Đặt 5 mảnh tử diệp lên lame mặt trong của tử diệp úp xuống, vào mỗi hộp petri. Nhỏ 10ml dung dịch BA có các nồng độ khác nhau từ 0-1 mg/l. Các hộp petri được đặt ở phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 300 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, ẩm độ ≥ 85%. Sau 2 ngày, thu tử diệp, thấm khô và cân lại để xác định sự sai biệt trọng lượng trước và sau khi thí nghiệm. Dựng đường tương quang tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) với nồng độ BA (mg/l).
Định lượng cytokinin trong mẫu:
Tiến hành sinh trắc nghiệm trên ở trên tử diệp dưa chuột tương tự như thí nghiệm dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), nhưng thay dung dịch BA bằng 10ml dung dịch cytokinin trích từ hoa cẩm chướng và một mẫu thay bằng nước cất để làm đối chứng.
Dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), suy ra lượng cytokinin trong hoa.
Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên hạt xà lách [7].
Hạt xà lách, rửa sạch và ngâm trong nước 1 giờ. Hạt được gieo vào hộp petri với giấy thấm ẩm, trong tối. Sau 24h, khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ, đặt 10 hạt xà lách vừa nãy mầm vào các erlen (mẫu, GA3 tinh khiết 10mg/l, nước cất), ( chú ý đừng để các hạt này ngập chìm trong dung dịch). Bao phủ becher bằng giấy parafin và đặt vào trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, ẩm độ ≥ 85 %. Sau 72 giờ, đo chiều cao của trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng thước mm (tính từ gốc đến bên dưới tử diệp). Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong
25
mỗi dung dịch so với chuẩn và các chất tinh khiết sẽ cho thấy hoạt tính tương đương của GA3 nội sinh.