2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP
2.3.2 Định lượng protein tổng số
Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu protein
Hòa tan vào 4ml đệm phosphate Lọc
Tủa bằng Ethanol tỉ lệ 1:1, ly tâm Nghiền với nước cất
Cánh hoa
Dịch chiết thô
Dịch trong
Thu tủa
18
Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [2]
Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng tạo màu với Comassie (Comassie Brilliant Blue – CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài g protein/ml, nhanh và dễ thực hiện.
Nguyên liệu và hóa chất:
- Dung dịch mẫu protein.
- Dung dịch albumin 1mg/ml cân chính xác 10mg albumin pha trong 1ml nước cất. Lắc đều cho tan, giữ 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lần được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford:
Coomassie Brilliant Blue (CBB) 0,001g Ethanol tuyệt đối 4,70 g
Acid phosphoric 85% 8,50 g
Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol, bổ sung acid phosphoric 85% và đong đủ nước cất đến 100ml.
Cách tiến hành:
Lập đường chuẩn:
Bảng 2.1. Bảng mô tả dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 Dung dịch albumin 0,1mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Thuốc thử Bradford (ml) 5 5 5 5 5 5 Định lượng protein trong mẫu:
19
- Bổ sung vào 1 ống nghiệm thành phần với thể tích như sau: Nước cất: 0,8ml; Dung dịch protein mẫu: 0,2ml; Dung dịch thuốc thử: 5ml
- Đo OD mẫu ở bước sóng 595 nm
- Dựa vào đường chuẩn ngoại suy ra nồng độ protein cần.
Tổng protein = nồng độ protein x độ pha loãng x thể tích mẫu. 2.3.3 Định lượng hàm lượng đường tổng số
Mục đích: khi hoa lão suy, hàm lượng đường cũng giảm theo [36]. Do đó theo dõi sự suy giảm hàm lượng đường tổng số sẽ đánh giá được độ bền của hoa.
Bố trí thí nghiệm:
- Cắt cánh hoa, rửa sạch rồi nghiền nhuyễn bằng cối trong cồn 90o theo thứ tự sau: 1-2g nguyên liệu + 10ml cồn 90o; Đun cách thủy (sôi 3 lần) rồi lọc lấy rượu 1; Bã: cho 10ml cồn 80o (đun 2 lần, để nguội) chiết 2 lần; Bã: rửa 2, 3 lần với cồn 80o, thu rượu 2; Rượu 1, 2 đun cách thủy đến khi vừa cạn khô; Cho thêm 50ml nước cất → dung dịch mẫu.
Dựng đường chuẩn:
- Dùng 7 bình định mức
- Cho vào các bình theo thứ tự lượng dung dịch sucrose 0.1% từ 1-7ml; Cho nước cất cho đủ 50ml; Lấy mỗi bình 1ml, cho thêm 1ml phenol 5% và 5ml H2SO4 đậm đặc; Để yên 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi đun cách thủy 10-20 phút đến khi xuất hiện màu thì đo OD490nm; Dùng ống thử không bằng nước cất. Xác định hàm lượng đường và hiệu suất:
- Hút 1ml mẫu + 1ml phenol 5% + 5ml H2SO4 đậm đặc
- Đo OD490nm, suy ra nồng độ đường
20
2.3.4 Phương pháp đánh giá dựa trên cảm quan
Chỉ tiêu cảm quan được đánh giá theo hệ thống thang điểm của Đề tài nghiên cứu phát triển một số chế phẩm xử lý sau thu hoạch cho hoa cắt cành, Viện khoa học Nông nghiệp miền Nam [10].
Độ tươi của hoa:
1 điểm: hoa héo tàn, đổi màu, bông hoa gục xuống.
3 điểm: cánh hoa bắt đầu mềm, có biểu hiện bạc màu hoặc đổi màu nhưng chưa héo.
5 điểm: cánh cứng, rất tươi, gần như không có biểu hiện bạc màu.
Độ tươi của lá:
1 điểm: bộ lá héo không có khả năng phục hồi.
3 điểm: một vài lá bắt đầu mềm, đầu lá héo, màu lá nhạt.
5 điểm: bộ lá còn tươi, sáng màu.
Tình trạng gốc:
1 điểm: có nhiều nhớt ở gốc, dịch quanh gốc có mùi hôi.
3 điểm: có nhớt xuất hiện ở gốc, gốc bị thâm.
5 điểm: không có hoặc có rất ít nhớt xuất hiện ở gốc, dung dịch không có mùi hôi.
Tình trạng thân:
1 điểm: thân bị thâm đen, mềm, gãy, đốt thân mềm, gãy.
3 điểm: thân bắt đầu dập một vài chỗ, đốt thân hơi mềm, thân vẫn thẳng
5 điểm: thân vẫn xanh, đốt thân cứng, thân thẳng.
Các biểu hiện không bình thường của hoa:
21
Thời gian cắm trung bình (theo đơn vị ngày) tại thời điểm hoa biểu hiện rõ các hiện tượng lão suy (bạc màu, vàng lá, kém tươi hoặc rũ xuống).
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 cây (8-10 bông hoa /nghiệm thức) (cẩm chướng);
Kết quả được thống kê trên phần mềm SPSS 15.0 . Trình bày dưới dạng bảng với số liệu biểu thị: Giá trị trung bình sai số chuẩn. Các số hạng trong cùng một cột nếu có cùng mẫu tự (không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức α = 0,05), nếu khác mẫu tự (có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức α = 0,05). Sự phân hạng được thực hiện theo phương pháp so sánh Tukey’s b.
Hình 2.1. Bảng điểm độ tươi của hoa
Hình 2.2. Bảng điểm thân và lá Cẩm chướng
1 điểm 3 điểm 5 điểm
22
2.3.5 Ly trích và định lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nguyên tắc:
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có thể được trích ly nhờ sự dùng dung môi hữu cơ metanol, etanol, acetone, chloroform…và thay đổi pH thích hợp. Sau đó, sự c ô lập các chất này được thực hiện nhờ phương pháp sắc ký.
Hoạt tính của auxin (AIA), cytokinin (zeatin), giberelin (GA3) và Acid abscisic xác định thông qua sinh trắc nghiệm.
Vật liệu:
Vật liệu li trích, hột xà lát, hột dưa chuột.
Hóa chất: Eter etylic, Metanol, Acid acetic, NaHCO3 8%, HCl 1%, NaOH 1%
Phương pháp:
Mẫu hoa + Methanol 80%
Nghiền, ủ 24 giờ, lọc (3 lần) Dịch trích Methanol
80%
Cô cạn Dịch tan trong nước (1ml)
Chỉnh pH 2,5 bằng HCl 1N,
Pha ether Pha nước
Pha ether (dịch trích ở
pha acid) trích ở pha trung tính) Pha n-butanol (dịch
Định lượng auxin, acid
abcisic, gibberelin Định lượng cytokinin
Rửa bằng NaHCO3 8% NNaHCO
Chỉnh pH 7 bằng NaOH 1N Lóng với n-butanol bão hòa (3 lần) Rửa bằng NaHCO3 8%
23
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Ly trích được thực hiện trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút không khí [7].
Định lượng auxin thô bằng phương pháp so màu [15]: Dựng đường tương quan giữa nồng độ IAA (mg/l) và OD530nm
Chuẩn bị 6 ống nghiệm và cho vào mỗi ống các chất theo bảng sau:
Bảng 2.2. Khảo sát sự tương quan giữa OD530nm và nồng độ IAA (mg/l)
Chú thích: ODi : giá trị OD530nm ở nồng độ IAA là i ODo : giá trị ODcủa nước cất.
- Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong vòng 1 giờ. Sau đó đem đi đo OD ở bước sóng 530nm.
- Tính kết quả: ODchuẩn = ODi – ODo
- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD530nm và nồng độ IAA.
Định lượng nồng độ IAA trong mẫu :
Tiến hành bổ sung vào ống nghiệm các thành phần sau: - Auxin trích ly được, pha loãng với nước cất: 5ml - Thuốc thử Salkowski : 3ml
Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong 1 giờ để auxin phản ứng với thuốc thử Salkowski. Sau đó đem đo OD ở bước sóng 530nm.
Tính kết quả: OD = ODmẫu - ODo , dựa vào đường tương quan giữa nồng độ IAA chuẩn và giá trị OD530nm , suy ra nồng độ auxin có trong dịch nuôi cấy.
Xác định hoạt tính cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên tử diệp dưa chuột [7].
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l).
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch IAA chuẩn 10mg/l (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0
Nước cất (ml) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 5
Nồng độ IAA (mg/l) 1 2 3 4 5 0
Thuốc thử Salkowski 3 3 3 3 3 3
24
Chọn những hạt dưa chuột có kích thước đều nhau, rửa sạch, ngâm trong 1 giờ. Sau đó đặt hạt vào đĩa petri có lót giấy thấm nước, ủ tối trong vòng 24 giờ.
Khi rễ mầm vừa nhú ra khỏi vỏ hạt khoảng 2-5 mm, lấy ra, lột vỏ cứng và lớp vỏ lụa, tránh làm tổn thương tử diệp.
Dùng giấy thấm quấn quanh lam, đặt vào trong đĩa petri, mỗi đĩa 1 lam.
Cân 5 mảnh tử diệp (sau khi được thấm khô cẩn thận trên giấy thấm) bằng cân phân tích. Đặt 5 mảnh tử diệp lên lame mặt trong của tử diệp úp xuống, vào mỗi hộp petri. Nhỏ 10ml dung dịch BA có các nồng độ khác nhau từ 0-1 mg/l. Các hộp petri được đặt ở phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 300 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, ẩm độ ≥ 85%. Sau 2 ngày, thu tử diệp, thấm khô và cân lại để xác định sự sai biệt trọng lượng trước và sau khi thí nghiệm. Dựng đường tương quang tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) với nồng độ BA (mg/l).
Định lượng cytokinin trong mẫu:
Tiến hành sinh trắc nghiệm trên ở trên tử diệp dưa chuột tương tự như thí nghiệm dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), nhưng thay dung dịch BA bằng 10ml dung dịch cytokinin trích từ hoa cẩm chướng và một mẫu thay bằng nước cất để làm đối chứng.
Dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), suy ra lượng cytokinin trong hoa.
Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên hạt xà lách [7].
Hạt xà lách, rửa sạch và ngâm trong nước 1 giờ. Hạt được gieo vào hộp petri với giấy thấm ẩm, trong tối. Sau 24h, khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ, đặt 10 hạt xà lách vừa nãy mầm vào các erlen (mẫu, GA3 tinh khiết 10mg/l, nước cất), ( chú ý đừng để các hạt này ngập chìm trong dung dịch). Bao phủ becher bằng giấy parafin và đặt vào trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, ẩm độ ≥ 85 %. Sau 72 giờ, đo chiều cao của trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng thước mm (tính từ gốc đến bên dưới tử diệp). Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong
25
mỗi dung dịch so với chuẩn và các chất tinh khiết sẽ cho thấy hoạt tính tương đương của GA3 nội sinh.
2.4 Bố trí thí nghiệm
2.4.1 Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình thường (cắm hoa với nước) thường (cắm hoa với nước)
Mục đích:
- Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình thường (cắm hoa với nước) qua từng ngày.
Vật liệu:
- Hoa cẩm chướng mới cắt, được vận chuyển từ Đà Lạt. Chọn những búp mới nở, có cùng kích thước.
Thực hiện:
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/ nghiệm thức.: Hoa được cắt xéo gốc, ngâm trong nước ấm 20 phút rồi cắm trong dung dịch cần khảo sát
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường, phytohormone của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn.
2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium sp.
Mục đích:
Vi khuẩn Methylobacterium có khả năng tiết phytohormone (auxin, cytokinin, Gibberellin) [3], [6], đồng thời có khả năng phân cắt ACC, tiền chất trung gian tổng hợp ethylene, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sinh khối khác nhau để tìm nồng độ vi khuẩn tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành.
26
Vật liệu:
Vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans H2T; Hoa Cẩm chướng được trồng tại DaSar Farm
Thực hiện:
- Vi khuẩn H2T được nuôi trong môi trường CMS, sau 4-5 ngày đạt giá trị OD610nm khoảng 0,695, tương đương mật độ vi khuẩn 2.1012 (cfu/ml) (ngoại suy từ đồ thị 5.1 phần phụ lục).
- Dùng dao sắc cắt xéo gốc, ngâm trong nước ấm 20 phút, sau đó cắ vào các lọ chứa dung dịch A, B, C với các nồng độ 1, 5, 10, 20, 50, 100 %
- Thí nghiệm được lập lại 3 lần với 3 cây (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/ nghiệm thức
Sơ đồ 2.2. Các loại dung dịch cắm hoa A, B
Vi khuẩn H2T
Môi trường CMS
Sinh khối Dịch sau ly tâm
(dịch B)
Dịch A (2.1012 cfu/ml) Pha loãng với nước cất
27
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn
2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ cho vi khuẩn
Methylobacterium sp. trong chế phẩm
Ảnh hưởng của các chất ức chế vi sinh vật gây thối
Khi cắm hoa, các vi sinh vật phát triển gây thối nước, đẩy nhanh quá trình lão hóa của
hoa cắt cành. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của các chất ức chế vi
sinh vật gây thối trên tuổi thọ của hoa cắt cành.
2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3
Mục đích:
- Khảo sát nồng độ dung dịch AgNO3 tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa cẩm chướng cắt cành
Vật liệu:
- Hoa Cẩm chướng được vận chuyển từ Đà Lạt sau khi cắt. Chọn những búp mới nở, có cùng kich thước
Thực hiện:
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/nghiệm thức. Các nồng độ AgNO3 là 0; 25; 30; 35 và 40 ppm
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường, phytohormone của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn.
28
2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của Aspirin
Mục đích:
- Khảo sát nồng độ dung dịch Aspirin tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa cẩm chướng cắt cành
Vật liệu:
- Hoa Cẩm chướng được vận chuyển từ Đà Lạt sau khi cắt. Chọn những búp mới nở, có cùng kich thước
Thực hiện:
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/nghiệm thức. Các nồng độ Aspirin khảo sát là 0, 200, 400, 600, 800, 1000 ppm.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường, phytohormone của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn.
2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của Javel
Mục đích:
- Khảo sát nồng độ dung dịch Javel tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa cẩm chướng cắt cành
Vật liệu:
- Hoa Cẩm chướng được vận chuyển từ Đà Lạt sau khi cắt. Chọn những búp mới nở, có cùng kich thước
Thực hiện:
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/nghiệm thức. Các nồng độ (Javel: Nước) được khảo sát là 0; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; 1:10; 1:12; 1:14
29
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn
2.4.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của Ethanol
Mục đích:
- Khảo sát nồng độ dung dịch Ethanol tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa cẩm chướng cắt cành
Vật liệu:
- Hoa Cẩm chướng được vận chuyển từ Đà Lạt sau khi cắt. Chọn những búp mới nở, có cùng kich thước
Thực hiện:
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/nghiệm thức. Các nồng độ Ethanol được khảo sát là 0; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4 %
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc
- Hàm lượng chlorophyll, protein, đường của hoa ở các nghiệm thức khi đối chứng tàn
2.4.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của Acetaldehyde
Mục đích:
- Khảo sát nồng độ dung dịch Acetaldehyde tối ưu có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa cẩm chướng cắt cành
30
Vật liệu:
- Hoa Cẩm chướng được vận chuyển từ Đà Lạt sau khi cắt. Chọn những búp mới nở, có cùng kich thước
Thực hiện:
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 8-15 hoa (với 5-10 hoa lớn và 3-5 nụ hoa)/nghiệm thức. Các nồng độ Acetaldehyde được khảo sát là 0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 %
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tuổi thọ; độ tươi của hoa, thân/ lá; độ cứng của gốc