2.2.12.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp trên gel acrylamide
Hoạt tính kháng khuẩn của EntP trong các mẫu thí nghiệm đƣợc xác định trực tiếp trên bản gel điện di protein [12], sử dụng L. monocytogenes ATCC 35152 làm vi khuẩn kiểm định. Dịch protein thu đƣợc sau khi tiến hành phản ứng cắt bằng DTT 50 mM đƣợc điện di Tricine-SDS-PAGE thành 2 bản. Sau khi điện di, một bản đƣợc nhuộm commassie blue để đối chiếu, bản còn lại đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc deion vô trùng trong khoảng 2 giờ rồi đặt nhẹ nhàng lên bề mặt đĩa thạch môi trƣờng BHI. Tiếp đó, 5 ml môi trƣờng thạch mềm BHI chứa 5 x 105
tế bào L. monocytogenes đƣợc phủ lên toàn bộ bản gel. Đĩa đƣợc ủ ở 4o C trong 2 giờ để EntP khuếch tán vào thạch sau đó ủ ở 37o C qua đêm để vi khuẩn mọc. Quan sát, đối chiếu và đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu.
2.2.12.2. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Hoạt tính kháng khuẩn của EntP trong các mẫu thí nghiệm đƣợc xác định theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch [53]. Phủ lên bề mặt đĩa môi trƣờng thạch 2 ml môi trƣờng thạch mềm chứa 2 x 105 tế bào vi sinh vật kiểm định. Đục lỗ trên thạch và nhỏ mẫu vào các lỗ theo dải nồng độ pha loãng mẫu. Ủ đĩa ở 4o
C trong 2 giờ sau đó chuyển sang 37o C qua đêm. Hoạt tính của bacteriocin sẽ đƣợc đánh giá thông qua chỉ số AU ml-1 (arbitrary unit per milliliter), đƣợc tính bằng
55
nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà tại nồng độ pha loãng đó, mẫu thí nghiệm vẫn thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định [29].
2.2.12.3. Phƣơng pháp xác định khả năng diệt L. monocytogenes của dịch protein ở 4o
C.
Vi khuẩn L. monocytogenes đƣợc chuẩn bi ̣ trong môi trƣờng BHI ở các nồng đô ̣: 102, 103, 5x103, 104, 105 và 106 CFU/ml. Thêm vào 450 l di ̣ch vi khuẩn 50 l dịch X33hisentP-etOH hoạt tính 800 AU/ml (tƣơng ứng với nồng độ 80AU/ml mẫu thí nghiệm). Dịch X33picZA-etOH đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng. Để hỗn hợp ở 4o C qua đêm. Cấy trải 100 l hỗn hợp di ̣ch ủ qua đêm lên đĩa thạch BHI , ủ đĩa ở
37o C qua đêm . Đếm số lƣơ ̣ng khuẩn la ̣c xuất hiê ̣n ở các đĩa và tính nồng độ vi khuẩn có trong mẫu.
2.2.12.4. Phƣơng pháp xác định khả năng diệt L. monocytogenes của HisentP ở điều kiện sinh trƣởng
0,5 ml dịch X33hisentP-etOH hoạt tính 800 AU/ml đƣơ ̣c thêm vào 4,5 ml dịch vi khuẩn L. monocytogenes đang sinh trƣởng ở pha log có nồng độ 106 CFU/ml (tƣơng đƣơng với nồng độ HisentP là 80AU/ml mẫu thí nghiệm ). Nuôi cấy lắc hỗn hợp ở 37o C, 150 vòng/phút. Sau nhƣ̃ng khoảng thời gian nhất đi ̣nh (30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 20 giờ) lấy mẫu dịch nuôi cấy , pha loãng 200 lần rồi trải 100
l lên đĩa thạch môi trƣờng BHI . Ủ đĩa ở 37o C qua đêm. Đếm số khuẩn lạc vi khuẩn mọc lên ở các đĩa và tính toán nồng độ vi khuẩn có mặt tại các thời điểm lấy mẫu sau khi bổ sung X33hisentP-etOH vào dịch vi khuẩn. Dịch X33picZA-etOH đƣợc sử dụng làm đối chứng.