Các chủng vi sinh vật, DNA và plasmid

2.1.1.1. Chủng vi sinh vật

- Chủng vi khuẩn E. coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] của hãng Invitrogen đƣợc sử dụng để chọn dòng và nhân dòng gen.

- Chủng vi khuẩn E. coli ER2566 [fhuA2 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr- 73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) endA1 (mcrC- mrr)114::IS10) của hãng BioLabs đƣợc sử dụng làm tế bào biểu hiện.

- Chủng vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 13709 (Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), L. plantarum JCM1149, L. plantarum

A88 JCM1048, L. algilis Lp A17, L. salivarius Lp B33, L. fermentum Lp B14, E. faecium JCM5804, E. faecium B650, S. Thermophilus Str. Thermo , E. coli, B. cereus, L. monocytogenes ATCC 35152 (Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đƣợc sử dụng làm sinh vật chỉ thị để đánh giá khả năng kháng khuẩn của EntP tái tổ hợp.

- Chủng nấm men P. pastoris GS115 [his4] và P. pastoris X33 của hãng Invitrogen đƣợc sử dụng làm chủng biểu hiện.

2.1.1.2. Plasmid

Plasmid pJET1/blunt (Fermentas) đƣợc sử dụng làm vector tách dòng. Hệ vector pTWIN1 (BioLabs), pPIC9 và pPICZA (Invitrogen) đƣợc sử dụng làm vector biểu hiện. Trình tự gen mã hóa cho EntP đƣợc lấy trên ngân hàng Gen quốc tế (Genbank) với ký hiệu AF005726.1.

2.1.1.3. Các trình tự DNA mồi

Mồi dài xuôi (ký hiệu entP-F1, bảng 2.1) gồm 91 nucleotide mang trình tự từ nucleotide thứ 1 đến nucleotide thứ 75 của gen entP với 2 nuclceotide đƣợc cải biến

38

là T thay cho G và T thay cho C tại vị trí 6 và 48 nhằm tránh bộ ba hiếm trong chủng biểu hiện mà vẫn đảm bảo trình tự amino acid trong protein sau dịch mã. Mồi dài ngƣợc (ký hiệu entP-R1, bảng 2.1) gồm 90 nucleotide mang trình tự từ nucleotide thứ 54 đến nucleotide cuối cùng (135) của gen entP. Hai mồi có một đoạn trình tự 18 nucleotide (đoạn gạch chân) có thể bắt cặp bổ sung ở nhiệt độ gắn mồi.

Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong luận án

STT Ký hiệu

mồi Trình tự DNA Mô tả

1 entP-F1 tcttctcgaggacccggctactcgttcatatggtaatggtgtttattgt aataatagtaaatgttgggttaactggggagaagctaaagag

Mồi dài, xuôi, thay thế 2 nucleotide 2 entP-R1 aattgcggccgcttaatgtcccatacctgccaaaccagaagccca

gccactaataacgattcctgcaatattctctttagcttctcccca Mồi dài, ngƣợc 3 entP- F2E/NdeI gcatatggctactcgttcttatggtaa NdeI Mồi ngắn, xuôi, thêm ví trí cắt NdeI 4 entP- R2E/SapI tgctcttctgcaatgtcccatacctgccaa SapI Mồi ngắn, ngƣợc, thêm ví trí cắt SapI 5 entP- pastoris F3/XhoI tctctcgagaaaagagctactcgttcatatggtaatggtgtttat XhoI Mồi ngắn, xuôi, thêm ví trí cắt XhoI 6 entP- pastoris F4/EcoRI EcoRI gtagaattccatcatcatcatcatcatgacccggctactcgttcatat ggtaatggtgtttat Mồi ngắn, xuôi, thêm ví trí cắt EcoRI 7 entP- pastoris R3/NotI aattgcggccgcttaatgtcccatac NotI Mồi ngắn, ngƣợc, thêm ví trí cắt NotI

8 5’ AOX1 5’ gactggttccaattgacaagc 3’ Mồi nhân đoạn gen

vùng AOX1

9 3’ AOX 5’ gcaaatggcattctgacatcc 3’ Mồi nhân đoạn gen

vùng AOX1

Mồi ngắn, xuôi entP-pastoris F3/XhoI, đƣợc thiết kế vị trí nhận biết bởi XhoI và trình tự cắt Kex2 ngay trƣớc đầu 5’ của gen entP nhằm bảo đảm trình tự hoàn

39

toàn tự nhiên của peptide EntP sau khi dịch mã trong nấm men. Mồi ngắn xuôi entP-pastoris F4/EcoRI đƣợc thiết kế vị trí nhận biết bởi EcoRI và đoạn trình tự 6 histidine – asparagin – prolin (vị trí phân cắt bởi acid formic) ngay trƣớc gen entP

phục vụ cho mục đích tinh sạch peptide trong dịch nuôi cấy sau dịch mã. Các cặp mồi khác có kích thƣớc từ 27 – 30 nucleotide đƣợc thiết kế thêm vị trí nhận biết của enzyme hạn chế ở 2 đầu để có thể dễ dàng đƣa gen entP vào các vector tƣơng ứng khác nhau. Các mồi đều đƣợc tổng hợp bởi hãng Amersham Pharmacia Biotech.