Hình 3.3. Sơ đồ biểu hiện gen entP trong tế bào E. coli ER2566 MCS blunt-end PCR product pJET1/blunt 3128 bps eco47IR PlacUV5 rep (pMB1) bla PstI pTWIN1-entP 6792 bps bla M13 ori ori rop lac I entP Mxe Intein CBD SapI NdeI SapI NdeI pJET1-entP 3260 bps eco47IR entP PlacUV5 rep (pMB1) bla (6437) SapI …… EcoRI NotI NcoI (6404) SapI PstI (7228) (5722) NdeI pTWIN1 7375 bps bla M13 ori ori rop lac I CBD Ssp Intein Mxe Intein CBD T4-DNA ligase SapI + NdeI T4-DNA ligase
Biểu hiện gen entP trong E. coli ER2566
SapI NdeI
Gen entP - sản phẩm của phản ứng Klenow
PCR
62
3.2.1. TÁCH DÕNG GEN entP VÀO VECTOR TÁCH DÕNG pJET1
3.2.1.1. Khuếch đại gen entP sử dụng cặp mồi đặc hiệu
Với mục đích đƣa vào vector pTWIN1 để biểu hiện trong tế bào E. coli
ER2566, cặp mồi đặc hiệu (ký hiệu entP-F2E/NdeI và entP-R2E/SapI, Bảng 2.1) dùng cho tách dòng gen entP đã đƣợc thiết kế thêm vị trí cắt của enzyme hạn chế
NdeI và SapI ở hai đầu. Theo tính toán, khi thực hiện phản ứng PCR với khuôn mẫu là sản phẩm của phản ứng Klenow ở trên sẽ thu đƣợc đoạn gen entP có kích thƣớc 135 bp, và hai đầu đoạn gen mang trình tự nhận biết của cặp enzyme hạn chế NdeI-
SapI. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% (Hình 3.4) cho thấy: sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu là một băng sáng duy nhất, sắc nét, có kích thƣớc > 100 bp, tƣơng đƣơng với kích thƣớc theo tính toán của gen entP, đủ tiêu chuẩn làm vật liệu cho tách dòng tiếp theo.
Hình 3.4. Phân tích sản phẩm khuếch đại gen entP bằng PCR trên gel agarose 1,7%
1: Sản phẩm PCR nhân gen entP với cặp mồi đặc hiệu; 2: Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)
3.2.1.2. Ghép nối gen entP vào vector tách dòng pJET1/blunt tạo vector pJET1-entP
Quá trình ghép nối gen entP vào vector tách dòng pJET1 đƣợc thực hiện theo quy trình của bộ sản phẩm pJET1 cloning kit. Trong quá trình nhân gen, enzyme đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR là Taq-DNA polymerase có tính năng gắn thêm một bazơ adenin (A) ở đầu 3’ của mỗi sợi DNA sau khi tổng hợp. Do đó, sản phẩm
entP (135 bp) 1000 500 100 200 bp 1 2
63
PCR sẽ thừa ra một bazơ A ở mỗi đầu. Hai bazơ A này đƣợc loại đi bằng enzyme tạo đầu bằng (DNA blunting enzyme) trong pJET1 cloning kit. Sản phẩm của phản ứng cắt này tiếp tục đƣợc ghép nối vào vector pJET1 nhờ enzyme T4 DNA ligase. Tỷ lệ phản ứng nối ghép gen là 3:1 giữa sản phẩm PCR và vector pJET1. Sản phẩm plasmid tái tổ hợp thu đƣợc sau phản ứng ghép nối đƣợc gọi là pJET1-entP và đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5 theo phƣơng pháp sốc nhiệt để tiến hành chọn dòng.
3.2.1.3. Biến nạp sản phẩm nối ghép vào tế bào E. coli DH5
Sản phẩm của phản ứng nối ghép bao gồm các plasmid tái tổ hợp mang gen
entP, các plasmid tự đóng vòng, các mảnh DNA ghép nối ngẫu nhiên. Để sàng lọc đƣợc plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn, chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm nối ghép vào tế bào E. coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, sử dụng bộ máy di truyền của tế bào chủ để sao chép, tạo lƣợng lớn các dòng gen, sau đó tách chiết các dòng gen đó để kiểm tra. Chi tiết phƣơng pháp tạo tế bào khả biến và quá trình biến nạp sốc nhiệt đã đƣợc trình bày trong phần vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu.
Để chọn đƣợc dòng plasmid mang đúng gen entP, một số dòng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy, tách plasmid và cắt kiểm tra bằng các enzyme hạn chế kết hợp với giải trình tự để kiểm tra gen.
3.2.1.4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1-entP bằng cặp enzyme hạn chế
NdeI và SapI
Plasmid tái tổ hợp pJET1-entP đƣợc cắt kiểm tra bằng cặp enzyme hạn chế
NdeI và SapI. Trong quá trình thiết kế mồi, trình tự nhận biết của hai enzyme này đã đƣợc đƣa vào hai đầu đoạn gen entP. Bản đồ enzyme cắt hạn chế của vector pJET1 cho thấy vector này có một trình tự nhận biết của SapI tại vị trí 1125 và không chứa trình tự nhận biết của NdeI. Đoạn gen SapI - entP - NdeI (đầu bằng) đƣợc đƣa vào vector tại vùng đa nối giữa vị trí XhoI (478) và XbaI (503). Nhƣ vậy, plasmid tái tổ hợp mang gen entP sẽ có 2 điểm cắt của enzyme SapI và 1 điểm cắt của enzyme
64
NdeI. Theo tính toán lý thuyết, dù gen đƣợc đƣa vào theo chiều nào, khi xử lý bằng hai enzyme này đều tạo ra 3 đoạn DNA có thể nhìn thấy trên bản gel điện di: đoạn thứ nhất có kích thƣớc bằng đúng gen entP (135 bp); đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 630 bp (vị trí 478 hoặc 503 đến 1125 - đoạn DNA trên vector bị cắt tại vị trí
SapI của pJET1); và đoạn thứ ba có kích thƣớc khoảng 2,5 kb là phần còn lại của vector.
Hình 3.5. (A) Sơ đồ cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1-entP bằng cặp enzyme NdeI và SapI
(B) Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme NdeI và
SapI trên gel agarose 1,7%.
1, 2, 3: Các dòng pJET1-entP cắt bằng NdeI và SapI; 4: thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)
Phân tích kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 1,7% (Hình 3.5) cho thấy: ở các đƣờng chạy từ 1 đến 3 đã xuất hiện 3 băng DNA có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể khẳng định những dòng tế bào này đều mang plasmid tái tổ hợp pJET1-entP.
1000 500 200 100 bp 1 2 3 4 entP ~ 630 bp 2,5 kb XhoI (478) SapI NdeI XbaI (503) pJET1-entP 3260 bps eco47IR entP PlacUV5 rep (pMB1) bla Sap I (1125) gen entP (132 bp) một phần vector (~ 630 bp) phần còn lại của vector
(2,5 kb)
(A)
Nde I + Sap I
65
3.2.1.5. Kiểm tra gen entP trong vector tách dòng bằng giải trình tự gen
Trong quá trình tiến hành PCR có thể xảy ra một số sai sót làm biến đổi thành phần nucleotide của sản phẩm PCR, gây ra các đột biến (nhƣ đột biến lệch khung đọc, đột biến vô nghĩa ...), ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của protein. Do đó, để chắc chắn gen entP đã đƣợc tách dòng có trình tự đúng, không bị đột biến, chúng tôi chọn một dòng plasmid tái tổ hợp đã đƣợc cắt kiểm tra để tiến hành giải trình tự gen.
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự gen entP trong pJET1-entP với trình tự gen entP
của chủng E. faecium P13 trên ngân hàng gen, mã số AF005726.1
Kết quả giải trình tự (Hình 3.6) cho thấy: gen entP trong vector tách dòng pJET1-entP có 135 nucleotide, tƣơng đồng 98% với trình tự DNA của gen entP trên ngân hàng gen với mã số AF005726.1. Hai nucleotide sai khác là kết quả của việc thiết kế mồi có chủ định nhằm cải biến mã cho phù hợp với hệ thống tổng hợp protein của tế bào chủ. Tuy nhiên, sau quá trình dịch mã, trình tự amino acid của EntP tái tổ hợp vẫn hoàn toàn trùng khớp với trình tự amino acid của EntP tự nhiên, do vậy có thể đảm bảo tính chất của protein này là không đổi.
Nhƣ vậy, gen entP đã đƣợc tách dòng thành công trong vector pJET1 và sẽ đƣợc đƣa vào vector pTWIN1 để biểu hiện trong tế bào E. coli ER2566.
3.2.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PTWIN1-ENTP
Trong thiết kế thí nghiệm, vector pJET1 chỉ đƣợc sử dụng cho mục đích tách dòng. Vì vậy, gen entP cần đƣợc chuyển từ vector này sang vector biểu hiện pTWIN1 là vector có nhiều ƣu điểm thuận lợi cho việc biểu hiện gen ngoại lai do có mang promoter mạnh. Mặt khác, do EntP là một protein có kích thƣớc rất nhỏ (khoảng 4,6 AF005726.1 entP AF005726.1 entP AF005726.1 entP
66
kDa) nên việc biểu hiện độc lập trong tế bào E. coli thƣờng gặp nhiều khó khăn do rất khó nhận biết khi bị các protease của vật chủ phân cắt. Mặt khác, tuy EntP không tác dụng trên vi khuẩn đích là E.coli từ môi trƣờng ngoại bào nhƣng cũng không loại trừ khả năng tế bào chủ bị ảnh hƣởng khi có mặt bacteriocin này đƣợc sinh ra từ nội bào. Để tránh hiện tƣợng này, một giải pháp đƣợc đƣa ra là biểu hiện những peptide ngắn, có khả năng gây độc tế bào chủ ở dạng dung hợp với một protein khác mà từ đó ngƣời ta có thể dễ dàng thu hồi lại protein đích thông qua phản ứng phân cắt đƣợc xúc tác bởi enzyme hoặc các tác nhân vật lý, hóa học. Theo đó, hệ vector pTWIN đƣợc thiết kế phù hợp cho việc biểu hiện protein ngoại lai ở dạng dung hợp với các intein. Trong nghiên cứu này, sau khi đƣợc nối ghép vào vector pTWIN1, đoạn gen entP mã hóa cho protein trƣởng thành của EntP sẽ đƣợc biểu hiện ở dạng dung hợp với Mxe GyrA intein (intein2) có gắn CBD (Chitin binding domain) là cấu trúc có khả năng liên kết với chitin. Phản ứng cắt EntP khỏi protein dung hợp đƣợc thực hiện đơn giản nhờ hoạt tính tự phân cắt của intein2 khi có mặt DTT.
3.2.2.1. Thu gen entP từ plasmid tái tổ hợp pJET1-entP
Nhƣ trong phần phân lập gen đã đề cập, khi thiết kế mồi trình tự nhận biết của hai enzyme cắt hạn chế NdeI và SapI đã đƣợc đƣa vào hai đầu đoạn gen entP. Do đó, vấn đề trở nên đơn giản khi sử dụng chính hai enzyme này để thu đoạn gen entP từ vector tách dòng. Đồng thời, để tiến hành nối ghép gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1 thì bản thân vector cũng phải đƣợc cắt mở vòng bằng chính hai enzyme trên để tạo đầu dính bổ sung. Vì vậy, vector pJET1-entP và vector pTWIN1 đƣơ ̣c tiến hành cắt song song bằng cùng một cặp enzyme cắt hạn chế NdeI và SapI. Sau khi các enzyme cắt hoàn toàn, đoạn gen entP và vector đƣợc tinh sạch và thu lại bằng cách cho qua cột Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%.
Kết quả trên điện di đồ (Hình 3.7) cho thấy ở đƣờng chạy số 4 xuất hiện một băng có kích thƣớc trong khoảng 100 đến 200 bp, tƣơng ứng với chiều dài của gen
67
Mặt khác, băng điện di trên đƣờng chạy của plasmid pTWIN1 nguyên vẹn cao hơn hẳn so với băng trên đƣờng chạy điện di của plasmid đã đƣợc xử lý bằng enzyme hạn chế, điều đó chứng tỏ vector pTWIN1 đã đƣợc cắt mở vòng bởi cặp enzyme hạn chế, sẵn sàng cho phản ứng nối ghép gen.
Hình 3.7. Điện di kiểm tra các đoạn gen đƣợc tinh chế bằng cột Qiagen.
1, 5: Thang DNA chuẩn 1 kb và 100 bp (Fermentas); 2: Plasmid pTWIN1 đƣợc cắt bởi
NdeI và SapI; 3: Plasmid pTWIN1; 4: gen entP
3.2.2.2. Nối ghép gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1 và biến nạp vào chủng biểu hiện E. coli ER2566
Sau khi cắt pTWIN1 bằng hai enzym NdeI và SapI, thu và tinh sạch đoạn gen
entP có kích thƣớc 135 bp, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nối ghép nhờ T4-DNA ligase. Vector tái tổ hợp thu đƣợc có tên là pTWIN1-entP. Sản phẩm nối ghép này đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli ER2566 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Để có dòng đối chứng, chúng tôi đã biến nạp vector pTWIN1 nguyên vẹn ban đầu vào chủng E. coli ER2566. Các sản phẩm biến nạp đƣợc chọn lọc dựa trên cơ chế kháng kháng sinh. Chỉ những tế bào E. coli nào đã tích hợp vector pTWIN1-entP
hoặc pTWIN1 nguyên vẹn mới có thể sống đƣợc trên môi trƣờng có Amp nhờ hoạt động của gen kháng kháng sinh bla trên vector.
3.2.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen entP trong vector tái tổ hợp pTWIN1-entP
Trong quá trình nối ghép gen vẫn có trƣờng hợp vector pTWIN1 tự đóng vòng
bp 2
1 3 4 5
pTWIN1/Nde I + Sap I
1000 500 200 100 entP 0,5 1 2 10 kb 6 pTWIN1
68
mà không chứa đoạn gen entP. Vì vậy, để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng, nuôi cấy thu tế bào, tách plasmid và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme hạn chế PstI và
NdeI.
Hình 3.8. A) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTWIN1-entP bằng cặp enzyme
PstI và NdeI
B) Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme
PstI và NdeI trên gel agarose 1,7%
1, 2, 3: Các dòng pTWIN1-entP cắt bằng PstI và NdeI; 4: thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas).
Theo tính toán lý thuyết, khi xử lý vector pTWIN1-entP bằng cặp enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 923 bp (gen entP và Intein2-CBD) và ~ 5,9 kb (phần còn lại của vector) (Hình 3.8A). Kết quả điện di phân tích sản phẩm cắt (Hình 3.8B) cho thấy, tại các đƣờng chạy số 1, 2 và 3 xuất hiện các băng có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán.
Để khẳng định về sự nối ghép thành công đoạn gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen. Kết quả cho thấy gen entP đã đƣợc
PstI pTWIN1-entP 6792 bps bla M13 ori ori rop lac I entP Mxe Intein CBD SapI NdeI PstI + NdeI
Phần còn lại của vector (~5,9 kb)
gen entP + Intein2-CBD (923 bp) 10 6 2 1 0,75 0,25 kb 1 2 3 4 ~5,9 kb 923 bp A) B)
69
cài vào vị trí giữa NdeI (5722) và SapI (6437) trên vector pTWIN1. Khung đọc mở (open reading frame – ORF) đƣợc thiết kế sẵn trên vector ở vi ̣ trí 5725 – 7227, đã bao gồm các bô ̣ ba khởi đầu và kết thúc. Nhƣ vâ ̣y, sau khi di ̣ch mã, peptide EntP sẽ đƣợc biểu hiê ̣n dƣới da ̣ng protein dung hợp EntP - MxeIntein - CBD. Sau khi liên kết EntP - MxeIntein đƣợc phân cắt bằng DTT , EntP đƣơ ̣c giải phóng có trình tƣ̣ hoàn toàn giống với EntP tƣ̣ nhiên mà không mang theo bất cƣ́ m ột amino acid ngoại lai nào (Hình 3.9). atacatatggctactcgttcttatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgttgg M A T R S Y G N G V Y C N N S K C W gttaactggggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggcttct V N W G E A K E N I A G I V I S G W A S ggtttggcaggtatgggacattgcatcacgggagatgcactagttgccctacccgagggc G L A G M G H C I T G D A L V A L P E G gagtcggtacgcatcgccgacatcgtgccgggtgcgcggcccaacagtgacaacgccatc E S V R I A D I V P G A R P N S D N A I gacctgaaagtccttgaccggcatggcaatcccgtgctcgccgaccggctgttccactcc D L K V L D R H G N P V L A D R L F H S ggcgagcatccggtgtacacggtgcgtacggtcgaaggtctgcgtgtgacgggcaccgcg G E H P V Y T V R T V E G L R V T G T A aaccacccgttgttgtgtttggtcgacgtcgccggggtgccgaccctgctgtggaagctg N H P L L C L V D V A G V P T L L W K L atcgacgaaatcaagccgggcgattacgcggtgattcaacgcagcgcattcagcgtcgac I D E I K P G D Y A V I Q R S A F S V D tgtgcaggttttgcccgcggaaaacccgaatttgcgcccacaacctacacagtcggcgtc C A G F A R G K P E F A P T T Y T V G V cctggactggtgcgtttcttggaagcacaccaccgagacccggacgcccaagctatcgcc P G L V R F L E A H H R D P D A Q A I A gacgagctgaccgacgggcggttctactacgcgaaagtcgccagtgtcaccgacgccggc D E L T D G R F Y Y A K V A S V T D A G gtgcagccggtgtatagccttcgtgtcgacacggcagaccacgcgtttatcacgaacggg V Q P V Y S L R V D T A D H A F I T N G ttcgtcagccacgctactggcctcaccggtctgaactcaggcctcacgacaaatcctggt F V S H A T G L T G L N S G L T T N P G gtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattggtcacatataacggc V S A W Q V N T A Y T A G Q L V T Y N G aagacgtataaatgtttgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgtt K T Y K C L Q P H T S L A G W E P S N V cctgccttgtggcagcttcaatgactgcaggaaggggatccggctgctaacaaagcccga P A L W Q L Q - L Q E G D P A A N K A R aaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcc K E A E L A A A T A E Q - L A - P L G A
Hình 3.9. Kết quả giải trình tƣ̣ gen và trình tự amino acid tƣơng ƣ́ng của plasmid tái
tổ hợp pTWIN1-entP
Phần màu xám: trình tự amino acid tƣơng ứng của gen entP. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt protein dung hơ ̣p bởi DTT.
Nhƣ vâ ̣y , gen entP đã đƣơ ̣c đƣa vào plasmid đ úng khung đọc và phù hợp
70
100% với thiết kế thí nghiệm. Căn cứ vào kết quả này, các dòng plasmid tái tổ hợp đã kiểm tra đƣợc sử dụng để nghiên cứu khả năng biểu hiện gen entP trong tế bào E. coli
ER2566.
3.2.3. BIỂU HIỆN GEN entP TRONG TẾ BÀO E. coli ER2566
Trong biểu hiện gen, bƣớc quan trọng cần phải làm là nuôi cấy các thể biến nạp trong môi trƣờng có chất cảm ứng promoter để có thể tổng hợp protein tái tổ hợp. Gen entP trong vector tái tổ hợp pTWIN1-entP hoạt động dƣới sự điều khiển của promoter T7lac. Promoter này đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG. Vì vậy, để nghiên cứu khả năng biểu hiện gen entP, các thể biến nạp đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chọn lọc LBA có chất cảm ứng IPTG.
Theo thiết kế thí nghiê ̣m , khi đƣợc cảm ứng với IPTG, dƣới sự điều khiển của promoter T7, chủng E. coli ER2566 mang plasmid tái tổ hợp pTWIN1-entP sẽ tổng hợp protein dung hợp EntP - MxeIntein - CBD có kích thƣớc khoảng 33 kDa. Trong khi đó, đối chứng là chủng E. coli ER2566 mang plasmid pTWIN1 sẽ tổng hợp protein dung hợp giữa 2 đoạn intein có kích thƣớc lớn hơn là 55 kDa. Kết quả biểu hiện gen trên hình 3.10 cho thấy, ở đƣờng chạy điện di protein tổng số của hai dòng tế bào (đƣờng chạy 1 và 2) đã xuất hiện các băng protein lớn, đậm nét, có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán.
Hình 3.10. Phân tích protein tổng số của các thể biến nạp E. coli ER2566 trên gel polyacrylamide 12,6%
1: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1 (Đối chứng); 2: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1-entP; 3: Protein pha tan của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1-entP; 4: Thang protein chuẩn (Fermentas).
45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 kDa 66.2 1 2 3 4 ~ 33 kDa 55 kDa
71
Để khẳng định các protein trên là protein dung hợp tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot. Trong thí