3.4.3.1. Thu hồi HisentP từ môi trƣờng lên men bằng (NH4)2SO4
Protein trong 25 ml dịch lên men có hoạt tính kháng khuẩn 100 AU/ml đƣợc kết tủa bằng ammonium sulfate ở các nồng độ: 10, 20, 30, 40 và 50%. Tủa protein đƣợc hòa lại bằng nƣớc, thẩm tích loại muối và chuẩn đến thể tích bằng 1/10 thể
kDa 17 14 8 6 3,5 hisentP hisentP
118
tích ban đầu (2,5 ml). Kết quả điện di kiểm tra protein và thử khả năng kháng khuẩn của dịch tủa cho thấy, HisentP kết tủa tốt và đảm bảo hoạt tính ở nồng độ ammonium sulfate từ 30 đến 50%. Hiệu suất thu hồi HisentP đạt 80% (Bảng 3.5, Hình 3.49).
Bảng 3.5. Khả năng thu hồi HisentP tái tổ hợp bằng (NH4)2SO4 AU của dịch protein (đơn vị/ml)
Nồng độ amonium sulfate kết tủa (%) 0 10 20 30 40 50
Đối chứng - X33PICZA 0 0 0 0 0 0
X33hisentP 100 0 25 800 800 800
Thể tích (ml) 25 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
AU tổng số (đơn vị/tổng thể tích) 2500 0 62,5 2000 2000 2000
Hiệu suất thu hồi (%) 100 0 2,5 80 80 80
Hình 3.49. Kiểm tra protein trong các phân đoạn tủa với (NH4)2SO4 bằng điện di Tricine-SDS-PAGE
T: Dịch trƣớc tủa; M: thang protein chuẩn MW-17S, Sigma.
3.4.3.2. Thu hồi HisentP từ môi trƣờng bằng NaCl
Protein trong 25ml dịch lên men có hoạt tính kháng khuẩn 100 AU/ml đƣợc kết tủa bằng NaCl ở các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4; 1,6%. Tủa protein đƣợc hòa lại bằng nƣớc, thẩm tích loại muối và chuẩn đến thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu (2,5 ml). Kết quả điện di kiểm tra protein và thử khả năng kháng khuẩn
M T 10% 20% 30% 40% 50% HisentP kDa 17 14 8 6 3,5
119
của dịch tủa cho thấy HisentP có thể kết tủa ở nồng độ NaCl 0,6 đến 1%. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi HisentP rất thấp, tối đa chỉ đạt 20% (Bảng 3.6 và Hình 3.50).
Bảng 3.6. Khả năng thu hồi HisentP bằng NaCl
AU của dịch protein (đơn vị/ml)
Nồng độ NaCl kết tủa (%) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Đối chứng - X33PICZA 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X33hisentP 100 0 100 200 200 200 0 0 0
Thể tích (ml) 25 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
AU tổng số (đơn vị/tổng thể tích) 2500 0 250 500 500 500 0 0 0
Hiệu suất thu hồi (%) 100 0 10 20 20 20 0 0 0
Hình 3.50. Kiểm tra protein trong các phân đoạn tủa với NaCl bằng điện di Tricine- SDS-PAGE
M: thang protein chuẩn MW-17S, Sigma.
3.4.3.3. Thu hồi HisentP từ dịch lên men bằng ethanol
Protein trong 25ml dịch lên men chủng X33hisentP có hoạt tính kháng khuẩn 100 AU/ml đƣợc kết tủa bằng ethanol đến các nồng độ: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 90% (v/v). Tủa protein đƣợc làm khô hoàn toàn và hòa lại bằng nƣớc đến thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu (2,5 ml). Kết quả điện di kiểm tra protein và thử khả năng kháng khuẩn của dịch tủa đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.51.
0,2% 0,4% 0,6% 0,8% M 1% 1,2% 1,4% 1,6% trƣớc tủa HisentP kDa 14 8 3,5 17 6
120
Bảng 3.7. Khả năng thu hồi HisentP bằng ethanol
AU của dịch protein (đơn vị/ml)
Nồng độ ethanol kết tủa (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
X33PICZA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X33hisentP 100 0 0 0 0 200 200 200 400 1000
Thể tích (ml) 25 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
AU tổng số (đơn vị/tổng thể tích) 2500 0 0 0 0 500 500 500 1000 2500
Hiệu suất thu hồi (%) 100 0 0 0 0 20 20 20 40 100
Hình 3.51. Kiểm tra protein trong các phân đoạn tủa với ethanol bằng điện di Tricine-SDS-PAGE
M: thang protein chuẩn MW-17S, Sigma.
Nhƣ̃ng kết quả thu đƣơ ̣c ở trên đã cho thấy HisentP tái tổ hợp bắt đầu kết tủa ở nồng độ ethanol 50% và tăng dần theo nồng độ ethanol. Khi cho protein phân tách trên gel Tricine-SDS-PAGE, ở mẫu có nồng độ ethanol cao, protein di chuyển chậm hơn. Lƣợng HisentP thu đƣợc là cao nhất khi tủa với 90% ethanol (Hình 3.51). Tƣơng ứng với kết quả này, hoạt tính kháng L. monocytogenes của dịch tủa protein bắt đầu xuất hiện khi tủa với nồng độ 50% ethanol. Hoạt tính này tăng dần và đạt tối đa ở dịch tủa với ethanol 90%, hiệu suất thu hồi HisentP đạt 100%. So sánh khối lƣợng kết tủa thu đƣợc ở nồng độ 40% và 90% chúng tôi nhận thấy không có sự chênh lệch lớn. Kết quả này chỉ ra rằng, để thu hồi protein HisentP, các protein lớn có thể đƣợc loại bỏ trƣớc ra khỏi tủa protein tổng số bằng cách tủa phân đoạn với
10% 20% 30% 40% 50% M 60% 70% 80% 90% 14 8 3,5 17 6 HisentP
121
50% ethanol, thu dịch nổi. Sau đó, nồng độ ethanol trong dịch nổi đƣợc tăng lên bằng cách bổ sung ethanol đến 90% để thu kết tủa HisentP tƣơng đối sạch.
Những kết quả thí nghiệm ở trên cho thấy phƣơng pháp kết tủa HisentP trong dịch lên men bằng ethanol cho hiệu suất cao nhất (100%). Protein thu đƣợc sau kết tủa không đòi hỏi quá trình xử lý loại muối và thẩm tích. Mặt khác, với mục đích ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, ethanol còn đọng lại trong cặn tủa có thể loại bỏ hoàn toàn và dễ dàng bằng đông khô, đảm bảo độ an toàn sinh học cho chế phẩm sau này. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp kết tủa bằng ethanol để thu HisentP cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thu hồi HisentP từ lượng lớn dịch lên men bằng ethanol công nghiệp
Ethanol công nghiệp đƣợc thêm từ từ vào 5 lít dịch lên men (hoạt tính 100 AU/ml) đến nồng độ 40%, khuấy đều nhẹ nhàng, loại bỏ cặn, bổ sung thêm cồn lên đến nồng độ 90%, để qua đêm. Kết tủa bám lại ở đáy bình đƣợc làm khô và hòa lại vào nƣớc đến thể tích bằng 1/20 thể tích dịch lên men ban đầu. Một phần protein không tan trong nƣớc đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm thu dịch nổi (Hình 5, Hình 6 phụ lục). Dịch protein sau tủa đƣợc thử hoạt tính kháng L. monocytogenes để xác định AU và pha loãng 5 lần để điện di kiểm tra protein kết hợp với phủ vi khuẩn.
Các kết quả trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.52 cho thấy phƣơng pháp này đã loại bỏ đƣợc một lƣợng lớn protein từ môi trƣờng nuôi cấy. Hiệu suất thu hồi HisentP đạt 80%. Dịch tủa protein thu đƣợc ký hiệu là X33hisentP-etOH và dùng cho các thí nghiệm sau.
Bằng phép thử Bradford, hàm lƣợng protein tổng số trong X33hisentP-etOH xác định đƣợc là 4 mg/ml. Dựa vào thang protein chuẩn đã biết hàm lƣợng, sử dụng phần mềm Quantity 1 phân tích hình ảnh điện di dịch tủa, nồng độ HisentP có trong dịch sau lên men đƣợc xác định sơ bộ là 25 g/ml, tƣơng ƣ́ ng với nồng đô ̣ HisentP trong dịch X33hisentP-etOH là 400 g/ml. Dịch lên men chủng X33PICZA cũng đƣợc xử lý tƣơng tự và chuẩn về nồng độ tƣơng đƣơng để dùng làm đối chứng , ký hiệu X33PICZA-etOH.
122
Bảng 3.8. Hiệu suất của quá trình kết tủa lƣợng lớn dịch lên men thu HisentP Thể tích (ml) Hoạt tính (AU/ml) Hoạt tính tổng số (x103 ) Hiệu suất (%) Dịch lên men 5000 100 500 100 Dịch tủa ethanol 250 1600 400 80
Hình 3.52. Phân tích dịch X33hisentP-etOH bằng Tricine-SDS-PAGE (A), phủ vi khuẩn L. monocytogenes thử hoạt tính trực tiếp trên gel (B) và xác định AU trên
thạch đĩa (C)
M: Thang protein chuẩn MW-17S, Sigma. Mũi tên chỉ chiều pha loãng theo cơ số 2 bắt đầu từ dịch gốc.
Trong số các công trình đã công b ố trên T hế giới cho đến nay , EntP là bacteriocin đầu tiên đƣơ ̣c biểu hiê ̣n trong P. pastoris có đầy đủ hoạt tính . Năm 2005 Gutiérrez đã tách dòng gen mã hóa cho EntP trƣởng thành vào vector pPICZA ta ̣i vị trí ngay sau tín hiệu phâ n cắt peptide và đƣa vào biểu hiê ̣n trong P. pastoris X33 nhằm thu đƣơ ̣c EntP trong môi trƣờng nuôi cấy . Bằng phƣơng pháp hấp phu ̣ miễn dịch gắn enzyme , lƣơ ̣ng EntP sinh ra trong môi trƣờng sau 6 giờ cảm ƣ́ng methanol xác định đƣợc là 28,2 g/ml, cao hơn 3,7 lần so vớ i chủng E. faecium P13. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy chủng tái tổ hơ ̣p cũng cao hơn 16 lần so với
123
dịch nuôi chủng E. faecium P13 [48].
So sánh với kết quả của l uận án , mă ̣c dù quá trình cảm ƣ́ng biểu hiê ̣n gen đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n ở mâ ̣t đô ̣ tế bào cao (OD600 = 50) trong các thiết bi ̣ lên men nhƣng hàm lƣợng HisentP sinh ra trong môi trƣờng không có sƣ̣ khác biê ̣t vƣợt trô ̣i, chỉ đạt 25 g/ml. Điều này cho thấy khả năng biểu hiện gen ngoại lai của chủng
X33hisentP chƣa cao , hoặc quá trình lên men chƣa đa ̣t đƣợc hiê ̣u suất nhƣ mong đơ ̣i. Tuy nhiên , sƣ̣ khác biê ̣t về phƣơng ph áp xác định hàm lƣợng EntP , HisentP cũng là một yếu tố cần xem xét khi so sánh các kết quả này.