2.2.5.1. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
Cấy chuyển 1 khuẩn lạc của tế bào E. coli vào trong ống nghiệm chứa 3 ml môi trƣờng LB có bổ sung Amp (100 g/ml), nuôi lắc qua đêm ở 37o C, 200 vòng /phút. Rót 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 5 phút tốc độ 6000 vòng/ phút, loại bỏ dịch nổi, thu tế bào. Tế bào đƣợc hoà đều vào 1 ml TE, ly tâm 5 phút tốc độ 6000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi. Hoà đều tế bào thu đƣợc với
49
100 l dung dịch I bằng máy vortex, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Bổ sung 200 l dung dịch II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA. Hỗn dịch sẽ trở nên trong suốt và quánh, ủ trong đá 7 phút. Bổ sung tiếp 150 l dung dịch III và đảo nhẹ, trong hỗn dịch sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đá 5 phút. Ly tâm 10 phút với tốc độ 14000 vòng/phút. Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf. Bổ sung 450 l dung dịch phenol/chloroform, trộn thật đều và ly tâm 10 phút, tốc độ 14.000 vòng/phút để loại protein và DNA nhiễm sắc thể. Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bƣớc trên với 400 l hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol (24:1). Bằng cách này lƣợng phenol còn sót lại sẽ bị loại khỏi dung dịch DNA. Tủa dịch pha trên với 2 lần thể tích cồn 100%, thêm dung dịch muối natri acetate tới nồng độ cuối cùng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa qua đêm ở - 20o C hoặc 2 giờ ở - 70o C. Thu DNA kết tủa trong dung dịch bằng cách ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần kết tủa đƣợc rửa với cồn 70% và thu lại bằng cách ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô tủa bằng máy Speed Vac, hoà tan DNA plasmid vào 30 - 40 l dung dịch TE, bảo quản ở - 20o
C.
Loại bỏ RNA có trong mẫu: RNA lẫn trong sản phẩm tách chiết DNA đƣợc loại bỏ bằng RNase. Bổ sung vào hỗn hợp DNA plasmid một lƣợng RNase để đạt nồng độ cuối cùng là 100 g/ml, ủ hỗn hợp ở 37oC trong thời gian 30 phút. DNA plasmit đƣợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.5.2. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P. pastoris
Nuôi chủng nấm men trong 10 ml môi trƣờng tối thiểu (MD, MD zeocin) ở 28 – 30o C đến OD600 đạt 5 – 10. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 - 10 phút, loại bỏ dịch nổi, thu tế bào. Rửa tế bào bằng 10 ml nƣớc vô trùng và thu lại bằng ly tâm nhƣ trên. Hòa tế bào vào 2 ml đệm SCED pH 7,5. Bổ sung 0,1 – 0,3 mg zymolyase, trộn đều, ủ ở 37o C trong 50 phút. Bổ sung 2 ml SDS 1%, trộn nhẹ nhàng và đặt lên đá (0 - 4o C) trong 5 phút. Bổ sung 1,5 ml potassium acetate, pH 8,9, trộn nhẹ nhàng. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 – 10 phút, thu dịch nổi. Bổ sung vào dịch nổi 2 lần thể tích ethanol, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 13.000 vòng phút trong 20 phút ở 4o C, thu kết tủa. Hòa tan tủa nhẹ nhàng vào 0,7 ml đệm TE pH 7,4 và
50
chuyển sang ống eppendoft. Chiết nhẹ nhàng bằng một thể tích tƣơng đƣơng phenol : chloroform (1/1). Chiết lần 2 bằng một thể tích chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Chia phân lớp nƣớc vào 2 eppendoft. Bổ sung vào mỗi thể tích nƣớc trong eppendoft 1/2 thể tích ammonium acetate pH 7,5 và 2 thể tích ethanol. Đặt lên đá khô 10 phút hoặc để ở - 20o
C trong 60 phút. Ly tâm 13.000 vòng phút trong 20 phút ở 4o C thu kết tủa. Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%. Làm khô tủa và hòa lại vào 50 l đệm TE pH 7,5, giữ ở - 20o
C.