Quá trình tổng hợp gen entP gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là tổng hợp gen entP khuôn mẫu từ cặp mồi dài và giai đoạn 2 là nhân gen entP từ khuôn mẫu là sản phẩm của giai đoạn 1.
Giai đoạn 1 có thể thực hiện theo 2 cách: phản ứng PCR tự mồi và phản ứng lấp đầy chuỗi nhờ enzyme Klenow.
Tổng hợp gen entP bằng kỹ thuật PCR tự mồi
PCR tự mồi là một trong các kỹ thuật phát triển từ PCR. Đây là phản ứng sử dụng cặp mồi dài có một đoạn trình tự DNA gối nhau để tiến hành tổng hợp kéo dài về hai phía của mồi. Giai đoạn gắn mồi trong phản ứng này đƣợc tiến hành ở nhiệt độ thấp nhằm tạo điều kiện cho cặp mồi bắt cặp với nhau và kéo dài. Sự bắt cặp
5’
5’ Klenow/Tag DNA polymerase
Cặp mồi dài với một đoạn trình tự gối nhau, tự bắt cặp bổ sung ở nhiệt độ gắn mồi
5’
5’ 3’
3’ Enzyme Klenow hoặcTag
DNA polymerase tổng hợp kéo dài chuỗi tạo gen entP
45
tƣơng đồng và kéo dài của các đoạn đƣợc tiếp tục diễn ra ở các chu kỳ sau. Sản phẩm của lần PCR tự mồi này đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo nhằm tăng số bản sao mong muốn. Một mẫu phản ứng PCR tự mồi đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Lƣợng (l)
Mồi xuôi entP-F1 (1 mM) 1 Mồi ngƣợc entP-R1 (1 mM) 1 Buffer for Taq (10X) 2,5
MgCl2 (25 mM) 2
dNTPs (2,5 mM) 2,5
Tag DNA polymerase (5u/l) 0,5
H2O 15,5
Tổng hợp gen entP nhờ phản ứng Klenow
Enzyme Klenow là một phân mảnh của DNA polymerase I có hoạt tính của DNA polymerase và 3’ 5’ exonuclease. Cặp mồi dài có một đoạn trình tự bổ sung đƣợc bắt cặp với nhau, khởi đầu cho quá trình lấp đầy chuỗi. Những phần khuyết sau khi mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp sẽ đƣợc enzym Klenow lấp đầy nhờ hoạt tính DNA polymerase. Tuy nhiên, Klenow còn có tác dụng nhƣ một exonuclease nên enzyme này sẽ cắt những nucleotide ở đầu 3’-OH tự do. Một mẫu phản ứng Klenow đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Lƣợng (l)
Mồi xuôi EntP F1 (1 mM) 3 Mồi ngƣợc EntP R1 (1 mM) 3 Buffer for Klenow (10X) 2,5
dNTPs (2,5 mM) 5
Klenow (5u/l - bổ sung sau) 2
H2O 9,5 Tổng thể tích 25 Chương trình PCR tự mồi: Bƣớc 1: 94o C - 2 phút Bƣớc 2: 94o C - 1 phút Bƣớc 3: 55o C - 1 phút Bƣớc 4: 72o C - 30 giây Bƣớc 5: Lặp lại 25 lần từ bƣớc 2 - 4 Bƣớc 6: 72o C trong 7 phút Bƣớc 7: giữ mẫu ở 4o C Chương trình phản ứng: Bƣớc 1: 94o C - 2 phút Bƣớc 2: 55o C - 2 phút
Bƣớc 3: bổ sung enzyme Klenow Bƣớc 4: 37o
C - 30 phút Bƣớc 5: 72o C trong 7 phút Bƣớc 6: giữ mẫu ở 4o C
46
Giai đoạn 2: Nhân gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng DNA khuôn là sản phẩm của phản ứng giai đoạn 1 và các cặp mồi đặc thù riêng cho từng hệ biểu hiện. Một phản ứng PRC thông thƣờng đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Lƣợng (l)
DNA khuôn 1
Mồi xuôi 1
Mồi ngƣợc 1
Buffer for Taq (10X) 2,5
MgCl2 (25 mM) 2
dNTPs (2,5 mM) 2,5
Taq-DNA polymerase (5u/l) 0,5
H2O 14,5
Tổng thể tích 25