Trong biểu hiện gen, bƣớc quan trọng cần phải làm là nuôi cấy các thể biến nạp trong môi trƣờng có chất cảm ứng promoter để có thể tổng hợp protein tái tổ hợp. Gen entP trong vector tái tổ hợp pTWIN1-entP hoạt động dƣới sự điều khiển của promoter T7lac. Promoter này đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG. Vì vậy, để nghiên cứu khả năng biểu hiện gen entP, các thể biến nạp đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chọn lọc LBA có chất cảm ứng IPTG.
Theo thiết kế thí nghiê ̣m , khi đƣợc cảm ứng với IPTG, dƣới sự điều khiển của promoter T7, chủng E. coli ER2566 mang plasmid tái tổ hợp pTWIN1-entP sẽ tổng hợp protein dung hợp EntP - MxeIntein - CBD có kích thƣớc khoảng 33 kDa. Trong khi đó, đối chứng là chủng E. coli ER2566 mang plasmid pTWIN1 sẽ tổng hợp protein dung hợp giữa 2 đoạn intein có kích thƣớc lớn hơn là 55 kDa. Kết quả biểu hiện gen trên hình 3.10 cho thấy, ở đƣờng chạy điện di protein tổng số của hai dòng tế bào (đƣờng chạy 1 và 2) đã xuất hiện các băng protein lớn, đậm nét, có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán.
Hình 3.10. Phân tích protein tổng số của các thể biến nạp E. coli ER2566 trên gel polyacrylamide 12,6%
1: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1 (Đối chứng); 2: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1-entP; 3: Protein pha tan của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1-entP; 4: Thang protein chuẩn (Fermentas).
45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 kDa 66.2 1 2 3 4 ~ 33 kDa 55 kDa
71
Để khẳng định các protein trên là protein dung hợp tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot. Trong thí nghiệm này, dựa trên thiết kế ban đầu là biểu hiện protein đích ở dạng dung hợp với protein intein có gắn với CBD, protein tái tổ hợp sẽ đƣợc xác định gián tiếp thông qua sự có mặt của CBD - protein có ái lực cao với chitin (Hình 3.11).
Hình 3.11. Kiểm tra sự biểu hiện EntPIntein2 tái tổ hợp bằng Western blot
1: Thang protein chuẩn (Fermentas); 2: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1 (Đối chứng); 3: Protein tổng số của dòng tế bào E. coli ER2566 mang pTWIN1-entP
Kết quả lai Western blot sử dụng kháng thể kháng CBD (Hình 3.11) cho thấy: ở đƣờng chạy protein tổng số của dòng E. coli tái tổ hợp mang pTWIN1-entP xuất hiện một băng màu đậm nét tại vị trí khoảng 33,5 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc của protein dung hợp EntPIntein2, còn ở dòng đối chứng thì không xuất hiện băng protein này. Trong khi đó, ở dòng đối chứng, ngoài protein có kích thƣớc 55 kDa, tƣơng đƣơng với protein dung hợp SspIntein-MxeIntein, liên kết rất tốt với kháng thể còn có một số protein với kích thƣớc nhỏ hơn 30 kDa cũng bắt cặp đƣợc với kháng thể kháng CBD. Điều này có thể đƣợc giải thích là do protein dung hợp giữa hai đoạn intein đã bị phân cắt một phần bởi protease hoặc các điều kiện môi trƣờng.
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đi đến kết luận đã biểu hiện thành công gen entP ở dạng dung hợp với Mxe GyrA intein trong tế bào E. coli ER2566. Tuy
1 2 3 kDa 120 86 47 34 26 20
SspIntein-MxeIntein
72