Hình 3.16. Sơ đồ quá trình biểu hiện gen entP, hisentP trong nấm men P. pastoris GS115
EcoRI + NotI
XhoI + NotI
8kp
Biểu hiện gen trong nấm men P. pastorisGS115
SalI
Biểu hiện gen trong nấm men P. pastorisGS115
81
3.3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICentP, pPIChisentP
Thu gen entP, hisentP từ cá c plasmid tái tổ hợp pJETentP, pJEThisentP
Chúng tôi đã tiến hành cắt song song vector pJETentP và vector pPIC9 bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và NotI, cắt vector pJEThisentP và vector pPIC9 bằng cặp enzyme EcoRI và NotI nhằm bộc lộ các đầu dính bổ sung đã thiết kế. Sau khi các enzyme cắt hoàn toàn, tiến hành thu, tinh sạch đoạn gen entP, hisentP và vector pPIC9 đã mở vòng qua cột Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.17) và sử dụng cho phản ứng nối ghép gen tiếp theo.
Hình 3.17. Điện di kiểm tra các đoạn gen sau khi tinh chế qua cột Qiagen
1, 2: Gen entP và hisentP; 3: Plasmid pPIC9; 4: Plasmid pPIC9 đƣợc cắt bởi XhoI-NotI; 5: Plasmid pPIC9 đƣợc cắt bởi EcoRI-NotI; 6: Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas)
Kết quả thể hiện trên điện di đồ cho thấy ở đƣờng chạy số 1 và 2 xuất hiện hai băng có kích thƣớc tƣơng ứng với gen entP và hisentP, chứng tỏ hai gen này đã đƣợc thu lại thành công sau khi tinh sạch qua cột Qiagen. Bên cạnh đó, đƣờng chạy plasmid pPIC9 nguyên vẹn cao hơn hẳn và bao gồm 2 băng, so với đƣờng chạy điện di hai plasmid đã đƣợc xử lý mở vòng bằng enzyme hạn chế là một băng duy nhất, sáng và sắc nét, có kích thƣớc đúng bằng kích thƣớc vector pPIC9, chứng tỏ vector pPIC9 đã đƣợc cắt mở vòng bởi cặp enzyme hạn chế. Nhƣ vậy, các thành phần của vector đã sẵn sàng cho phản ứng nối ghép gen.
1 2 3 4 5 6 bp – 250 – 1.000 – 2.000 – 10.000
82
Ghép nối gen entP , hisentP vào vector pPIC 9 và biến nạp vector biểu hiện pPICentP và pPIChisentP vào tế bào E. coli DH5
Phản ứng nối ghép đƣợc thực hiện nhờ tác dụng của T4-DNA ligase ở 16o
C trong 16 giờ. Tỷ lệ giữa các thành phần trong phản ứng: entP, hisentP/ pPIC9 tƣơng ứng là 3:1. Sản phẩm của phản ứng là 2 vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pPICentP, pPIChisentP.
Để chọn plasmid mang đúng gen nhƣ thiết kế trƣớc khi đƣa vào chủng biểu hiện, sản phẩm của phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trƣờng LBA. Nhờ hoạt động của gen kháng Amp có mặt trên plasmid pPIC9, chỉ những thể biến nạp nào có chứa vector tái tổ hợp pPICentP, pPIChisentP hoặc vector pPIC9 tự đóng vòng mới có thể sinh trƣởng và tạo thành khuẩn lạc. Để chọn đƣợc các dòng chứa vector tái tổ hợp pPICentP, pPIChisentP chúng tôi đã nuôi cấy một số chủng tái tổ hợp, tách chiết DNA plasmid và cắt kiểm tra plasmid bằng các enzyme hạn chế.
Hình 3.18. Điện di sản phẩm cắt các vector tái tổ hợp trên gel agarose 1,2%
1-3: pPICentP đƣợc cắt bởi Xho I-Not I; 4-6: pPIChisentP đƣợc cắt bởi EcoRI-NotI; 8: thang DNA chuẩn 50 bp; 9-11: các plasmid pPICentP, pPIChisentP, pPIC9; 12 : thang DNA chuẩn 1kb ; 13-15: vector pPICentP, pPIChisentP, pPIC9 đƣợc cắt bởi SalI.
Theo tính toán, vector pPICentP và pPIChisentP khi đƣợc cắt bởi các cặp enzyme hạn chế tƣơng ứng là XhoI-NotI và EcoRI-NotI sẽ cho ra các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng là 158 bp, 173 bp. Mặt khác, do trên trình tự 5’ AOX1 của
1 2 3 4 5 6 7 8 - 100 - 50 - 200 - 300 - 500 - 1000 bp 9 10 11 12 13 14 15 - 250 - 500 - 750 - 1000 - 10000 - 8000 - 1500 - 2000 bp
83
vector gốc có chứa một vị trí nhận biết của enzyme SalI trong khi trên gen
entP, hisentP không có vị trí này nên với cả 3 loại vector, khi cắt bằng enzyme SalI
đều đƣợc mở vòng. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 3 loại vector với các enzyme hạn chế khác nhau trên hình 3.18 hoàn toàn trùng khớp với tính toán chứng minh rằng gen entP và hisentP đã đƣợc đƣa vào trong vector pPIC9.
Một dòng plasmid pPICentP và plasmid pPIChisentP có sản phẩm cắt đúng nhƣ tính toán đƣợc tinh sạch và giải trình tự để khẳng định khung đọc trên vector biểu hiện. ctcgagaaaagagctactcgttcatatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgt L E K R A T R S Y G N G V Y C N N S K C tgggttaactggggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggct W V N W G E A K E N I A G I V I S G W A tctggtttggcaggtatgggacattaagcggccgc S G L A G M G H - A A ctcgagaaaagagaggctgaagcttacgtagaattccatcatcatcatcatcatgacccg L E K R E A E A Y V E F H H H H H H D P gctactcgttcatatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgttgggttaactgg A T R S Y G N G V Y C N N S K C W V N W ggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggcttctggtttggca G E A K E N I A G I V I S G W A S G L A ggtatgggacattaagcggccgc G M G H - A A
Hình 3.19. Kết quả giải trình tƣ̣ gen và trình tự amino acid tƣơng ƣ́ng của vùng gen ngoại lai trên plasmid tái tổ hợp pPICentP (A) và pPIChisentP (B)
Phần màu xám: trình tự amino acid tƣơng ứng của gen entP. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt protein dung hơ ̣p sau di ̣ch mã, mũi tên chỉ vị trí phân cắt bởi axit formic.
Kết quả giải trình tự trên hình 3.19 cho thấy: trình tự của 2 plasmid tái tổ hợp trùng khớp với thiết kế ban đầu và phù hợp với khung đọc trên vector biểu hiện. Với plasmid pPICentP, peptide EntP sau di ̣ch mã có trình tự hoàn toàn giống với EntP tƣ̣ nhiên mà không mang theo bất cƣ́ mô ̣t amino acid ngoa ̣i lai nào . Ở plasmid pPIChisentP, protein tái tổ hơ ̣p sau di ̣ch mã chƣ́a mô ̣t đoa ̣n trình tƣ̣ 6 histidine phu ̣c vụ cho mục đích tinh chế nhờ sắc ký ái lƣ̣c. Đoa ̣n amino acid này sẽ bi ̣ cắt dƣới tác dụng của axit formic để giải phóng peptide EntP có trình tự giống với trình tự của
XhoI
EcoRI
A
84
EntP tƣ̣ nhiên và mang thêm 1 amino acid Proline ở đầu N.
Dƣ̣a trên kết quả giải trình tƣ̣ này , plasmid pPICentP và pPIChisentP đƣợc chuẩn bị với lƣợng lớn dùng cho tích hợp vào hệ gen nấm men P. pastoris GS115.
3.3.2.2. Tích hợp vector biểu hiện pPICentP và pPIChisentP vào hệ gen của nấm men P. pastoris GS115
Để định hƣớng vector tích hợp hiệu quả vào gen his4 đã bị đột biến trong hệ gen của nấm men P. pastoris GS115, khoảng 10 g vector biểu hiện pPICentP, pPIChisentP đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme hạn chế SalI nằm trong trình tự gen
HIS4. Đồng thời, để tạo chủng nấm men tái tổ hợp mang vector gốc, không chứa gen tái tổ hợp làm đối chứng cho các thí nghiệm biểu hiện sau này, vector pPIC9 cũng đƣợc xử lý tƣơng tự. Sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để đảm bảo các vector pPICentP, pPIChisentP, pPIC9 đã đƣợc cắt hoàn toàn, sản phẩm cắt đƣợc cho qua cột Quiagen để làm sạch và cô đặc, tăng hàm lƣợng DNA trong mẫu, đủ điều kiện cho xung điện tích hợp vào hệ gen nấm men.
GS115 là chủng nấm men mang gen his4, bị đột biến khuyết dƣỡng histidine. Trên plasmid pPIC9 có mang gen HIS4, vì vậy, chỉ những tế bào P. pastoris GS115 đã tích hợp plasmid pPICentP, pPIChisentP, pPIC9 mới có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng MD (môi trƣờng tối thiểu) không chứa histidine.
Thí nghiệm biến nạp plasmid pPICentP, pPIChisentP, pPIC9 đã đƣợc chúng tôi thực hiện nhiều lần. Tuy nhiên, với plasmid pPICentP, tất cả các lần biến nạp đều không tạo đƣợc thể nấm men tái tổ hợp. Ngƣợc lại, plasmid pPIChisentP đƣợc đƣa vào hệ gen nấm men rất dễ dàng. Hiệu suất biến nạp giữa các lần hầu nhƣ không có chênh lệch. Các thể nấm men tái tổ hợp tạo thành (ký hiệu từ GShisentP1 đến GShisentP20 và GSpic9 - mang vector pPIC9) sinh trƣởng khá ổn định sau biến nạp. Để khẳng định về kiểu gen của chủng tái tổ hợp trƣớc khi thực hiện các thí nghiệm biểu hiện, DNA hệ gen của một số chủng nấm men GShisentP đã dƣợc tách chiết để kiểm tra.
Khi biến nạp vào hệ gen nấm men P. pastoris GS115, vector pPIC9, pPIChisentP tạo một trao đổi chéo giữa gen HIS4 trên vector và locus his4 trên hệ
85
gen. Kết quả là plasmid đã mở vòng tại vị trí SalI đƣợc cài vào vị trí his4 tạo kiểu hình Mut+ (methanol utilization). Khi tiến hành PCR với cặp mồi AOX1 sẽ thấy xuất hiện 2 băng: một băng có kích thƣớc 2,2 kb chính là đoạn gen AOX1 trong hệ gen nấm men, đoạn thứ hai có kích thƣớc bằng kích thƣớc đoạn gen ngoại lai cộng với 449 bp (kích thƣớc đoạn gen AOX1 trên vectơ). Ngoài ra, một xác suất nhỏ có thể xuất hiện đó là sự tái tổ hợp cũng có thể xảy ra ở đầu 3’AOX1, vùng kết thúc phiên mã, plasmid tạo một trao đổi chéo kép, thay thế hoàn toàn vùng AOX1 trong hệ gen nấm men, làm mất hoàn toàn gen AOX1 dạng dại và tạo kiểu hình MutS
(methanol utilization slow). Khi tiến hành PCR với cặp mồi AOX1 sẽ không thấy xuất hiện băng có kích thƣớc 2,2 kb. Hai kiểu hình Mut+ và MutS có những đặc điểm về tốc độ sinh trƣởng và trao đổi chất khác nhau, vì vậy, trƣớc khi thực hiện biểu hiện gen cần xác định rõ kiểu hình của các thể tái tổ hợp để có thiết kế thí nghiệm phù hợp.
Các dòng nấm men GShisentP tái tổ hợp (ký hiệu từ 1 đến 20) và Gspic9 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MD lỏng và tiến hành tách chiết DNA hệ gen để kiểm tra sự có mặt của gen ngoại lai. DNA hệ gen này đƣợc dùng làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR sử dụng 2 loại mồi: cặp mồi đặc hiệu đã dùng để nhân gen trong tách dòng (ký hiệu entP-pastoris F4/EcoRI và entP-pastoris R3/NotI, Bảng 2.1) và cặp mồi AOX1.
Với că ̣p mồi đặc hiệu (Hình 3.20A), 3 dòng tế bào GShisentP 13, 14, và 15 đƣợc kiểm tra đều ta ̣o thành mô ̣t băng duy nhất c ó kích thƣớc bằng đúng kích thƣớc gen hisentP (173 bp) đã đƣa vào vector trong khi chủng GSpic 9 không thấy có sản phẩm tạo thành do trong hệ gen không chứa đoạn gen ngoại lai. Nhƣ vậy trong hệ gen nấm men đã chứa gen cần biểu hiện.
Với că ̣p mồi A OX1 (Hình 3.20B), tất cả thể tái tổ hợp đƣợc kiểm tra đều ta ̣o thành hai băng trong đó 1 băng có kích thƣớc 2,2 kb chính là gen AOX1 trên hệ gen nấm men. Băng thứ 2 có kích thƣớc khoảng 0,7 kb, bằng kích thƣớc gen hisentP
(173bp) cộng với 449 (kích thƣớc của đoạn gen gen vector). Với chủng GSpic9 làm đối chứng, do mang plasmid pPIC9 không chứa gen ngoại lai trong vùng AOX nên
86
băng thứ 2 này có kích thƣớc thấp hơn hẳn, ứng với kích thƣớc của đoạn gen AOX1 trên vector gốc bằng 449bp. Nhƣ vậy, tất cả các thể tái tổ hợp đều mang gen nhƣ mong đợi và đều ở dạng Mut+
.
(A) (B)
Hình 3.20. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng gen entP và hisentP sử dụng cặp mồi đặc hiệu (A) và cặp mồi AOX1 (B)
1-3: sản phẩm từ khuôn mẫu là hệ gen các chủng GShisentP13, 14, 15; 4: khuôn mẫu là hệ gen chủng GSpic9 ; 5 : khuôn mẫu là plasmid pPIChisentP; 6 : thang DNA chuẩn 50 bp (A) và 1 kb (B).
3.3.2.3. Biểu hiện gen entP, hisentP trong nấm men P. pastoris GS115
Các chủng nấm men đƣợc nuôi cấy, cảm ứng biểu hiê ̣n gen ngoa ̣i lai trong môi trƣờng BMMY 0,5% methanol và thu mẫu dịch nuôi cấy sau 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, và 72 giờ cảm ứng. Sau khi ly tâm loại tế bào, dịch nuôi cấy cảm ứng đƣợc lọc qua màng lọc khuẩn và kiểm tra hoạt tính kháng L. monocytogenes và S. aureus
bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên đĩa thạch.
Các kết quả thu đƣợc thể hiện hình 3.21 và 3.22 cho thấy: trong số các dòng nuôi cấy, chỉ có dịch ngoại bào của dòng GShisentP15 có hoạt tính kháng khuẩn, tuy nhiên hoạt tính này rất yếu. Bên cạnh đó, hoạt tính kháng khuẩn này chỉ thể hiện ở thời điểm 4 đến 6 giờ sau khi cảm ứng. Khi điện di kiểm tra protein có trong dịch nuôi trên gel acrylamide chúng tôi không quan sát thấy băng protein có kích thƣớc quan tâm. Điều này có thể do protein HisentP tái tổ hợp đƣợc biểu hiện với mức độ rất thấp và bị phân cắt nhanh bởi các protease tiết ra môi trƣờng của nấm men.
- 50 1 2 3 4 5 6 - 100 - 200 - 300 - 1000 bp bp 1 2 3 4 5 6 - 250 - 750 - 500 - 1000 - 2000- 2500 - 10000
87
Hình 3.21. Hoạt tính kháng S. aureus (a) và L. monocytogenes (b) của dịch lên men các chủng GShisentP11 đến 15. ĐC: đối chứng, dịch lên men chủng GSpic9
Hình 3.22. Hoạt tính kháng S. aureus của dịch lên men chủng GShisentP15 theo thời gian cảm ứng (giờ)
3.3.2.4. Tinh sạch sơ bộ, thu protein HisentP và thử khả năng kháng khuẩn
Kết tủa protein trong dịch nuôi cấy bằng ammonium sulfate
Do protein HisentP có kích thƣớc nhỏ và hiệu quả biểu hiện không cao nên chúng tôi đã tiến hành tủa 20 ml dịch nuôi cấy thu sau 6 giờ cảm ứng với ammonium sulfate 49,3%. Tủa protein thu đƣợc sau ly tâm đƣợc hòa lại trong 200 μl đệm photphat 10 mM pH 5. Thẩm tích loại muối trong 8 giờ với màng thẩm tích giới hạn 1000 Da. Protein trong môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điện di trên gel Tricine SDS-PAGE 16,5%. Kết quả thể hiện ở hình 3.23 chỉ ra rằng: trong môi trƣờng nuôi cấy chủng GSpic9 không thấy xuất hiện băng protein nào có kích thƣớc nhỏ tƣơng
0 4 6 8 10 12 24 48 36 72 Amp Amp 15 ĐC Amp ĐC 15 11 12 13 14 11 12 13 14
88
ứng với kích thƣớc của protein HisentP. Trong khi đó, ở dịch nuôi cấy chủng GshisentP15 thấy xuất hiện một băng protein có kích thƣớc nhỏ hơn 14 kDa rất nhiều, có thể tƣơng đƣơng với kích thƣớc của protein HisentP.
Hình 3.23. Điện di Tricine-SDS-PAGE tủa protein từ dịch nuôi chủng GShisentP15 sau 6 giờ cảm ứng
1: Thang protein chuẩn; 2: Tủa protein từ dịch nuôi chủngGSpic9 sau 6 giờ cảm ứng; 3: Tủa protein từ dịch nuôi chủng GshisentP15 sau 6 giờ cảm ứng.
Hình 3.24. Kiểm tra sự có mặt của proteinHisentPtrong dịch nuôi cấy chủng
GShisentP15 bằng phƣơng pháp Western blot với kháng thể kháng Histag
1: Thang protein chuẩn; 2, 3, 4: Tủa protein từ chủngGSpic9 sau 6, 24, 48 giờ cảm ứng; 5, 6, 7: Tủa protein từ chủngGShisentP thu sau 6, 24, 48 giờ cảm ứng
Để khẳng định đây là protein tái tổ hợp mong đợi chúng tôi đã tiến hành làm Western blot lai với kháng thể kháng Histag . Dựa trên thiết kế ban đầu , protein đích đƣơ ̣c biểu hiện dƣới dạng dung hợp với 6 histidine, EntP tái tổ hợp sẽ đƣợc xác định
kDa 66– 45– 35– 25– 18– 14– 1 2 3 HisentP 1 2 3 4 5 6 7 kDa 14 – 18 – 25 – 45 – 35 – HisentP
89
gián tiếp thông qua sự có mặt của Histag. Kết quả lai trên hình 3.24 cho thấy: Tƣơng ứng với vị trí của băng protein quan tâm trên bản điện di xuất hiện một vạch màu rõ rệt trên màng lai, chứng tỏ protein này có khả năng liên kết với kháng thể kháng Histag. Nhƣ vậy, HisentP đã đƣợc tổng hợp trong tế bào nấm men. Tuy nhiên vệt protein này chỉ thấy xuất hiện ở mẫu thu sau 6 giờ cảm ứng. Ngoài ra, trên màng lai còn xuất hiện một số băng protein bắt với kháng thể nhƣng có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc của HisentP. Những protein này có thể là các dạng cấu trúc khác nhau của EntP. Kết quả này cũng chỉ ra rằng HisentP không ổn định trong môi trƣờng nuôi cấy, có thể bị phân cắt bởi chính các protease tiết ra môi trƣờng của nấm men.
Tinh sạch protein HisentP tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Histrap
Khi thiết kế mồi cho biểu hiện gen entP trong nấm men, protein EntP đã đƣợc dung hợp thêm trình tự của 6 histidine ở đầu N tạo protein HisentP. Dƣới điều kiện pH thích hợp (pH 7,5), ion Ni2+
gắn thêm hạt Sepharose sẽ tạo liên kết tĩnh điện với đuôi histidine, nhờ vậy, có thể tinh sạch đƣợc qua cột sắc kí ái lực Histrap.
1 ml dịch protein tủa ammonium sulfate từ 100 ml dịch nuôi chủng GShisentP15 thu sau khi cảm ƣ́ng 6 giờ đƣợc thẩm tích loại muối, hòa vào đệm bám cột (binding buffer) và cho qua cột Ni2+. Theo nguyên tắc, các protein có mang Histag sẽ bị giữ lại cột. Sau khi rửa cột nhiều lần bằng dung dịch đệm rửa để loại bỏ các protein không gắn cột, protein gắn cột sẽ đƣợc thu lại nhờ dịch thu (elution buffer) có chứa Imidazole 500 mM. Sản phẩm protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc loại muối, kiểm tra khả năng bắt cặp với kháng thể kháng Histag bằng phƣơng