BIỂU HIỆN GEN entP TRONG NẤM MEN P pastoris

3.3.1. TÁCH DÕNG GEN entP VÀO VECTOR TÁCH DÕNG pJET1

Gen entP đƣợc đƣa vào biểu hiện trong nấm men theo hai dạng: Dạng thứ nhất: gen entP phiên mã cho protein EntP trƣởng thành. Với dạng này, gen entP

đƣợc đặt ngay sau vị trí mã hóa cho điểm phân cắt protein ngoại lai trên vector. Nhƣ vậy, sau khi biểu hiện, EntP thu đƣợc là dạng hoàn toàn giống với EntP trƣởng thành sinh ra từ E. feacium P13. Dạng thứ 2 là gen hisentP bao gồm gen entP và mô ̣t đoạn oligonucleotide mã hóa cho hexahistidine-asparagin-prolin ở đầu 5’ phiên mã cho protein HisentP có trình tự (His)6-Asp-Pro-EntP. Trong đó Asp-Pro là vị trí sẽ bị cắt bởi axit formic để tạo ra EntP hoàn chỉnh. Protein tái tổ hợp EntP, HisEntP cũng đƣợc định hƣớng tiết ra ngoài môi trƣờng nhờ tín hiệu tiết MF- pro đã đƣợc thiết kế sẵn trên vector pPIC9 và pPICZA. EntP là một peptide có kích thƣớc nhỏ (4,4 kDa) nên với thiết kế biểu hiện gen entP theo dạng thứ nhất, sự biểu hiện của gen entP trong tế bào nấm men dù với một lƣợng rất nhỏ cũng có thể đƣợc phát

75

hiện và đánh giá trực tiếp dựa vào khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy sau khi cảm ứng promotor AOX1. Tuy nhiên, cũng bởi kích thƣớc nhỏ nhƣ vậy, việc tinh sạch EntP từ môi trƣờng lên men có thể sẽ gặp khó khăn. Vì vậy, mục đích ban đầu của chúng tôi khi thiết kế dạng thứ 2 có thêm đoạn dung hợp 6 His ở đầu N của EntP là giúp cho quá trình nhận biết và tinh chế protein thuận lợi hơn trong khi vẫn có thể đánh giá sơ bộ sự biểu hiện của gen nhờ đầu C của HisentP vẫn đƣợc giữ nguyên.

Thiết kế này đƣợc so sánh với công trình biểu hiê ̣n gen mã hóa cho divercin V41, một bacteriocin lớp IIa có hoa ̣t tính kháng Listeria rất mạnh với nhiều đă ̣c tính cấu trúc tƣơng đồng với EntP . Trong đó, peptide divercin V41 trƣởng thành (4,509 kDa) đƣợc biểu hiê ̣n dƣới da ̣ng protein dung hợp TRX-(His)6-DvnRV41 trong tế bào E. coli K-12 Origami (DE3)(pLysS). Chỉ 3 giờ sau khi cảm ƣ́ng với IPTG , protein pha tan của tế bào tái tổ hợp có chƣ́a TRX-(His)6-DvnRV41 đã có hoạt tính kháng L. innocua F khá ma ̣nh (100 AU/ml). Nhƣ vâ ̣y, mă ̣c dù mang theo peptide TRX-(His)6 (17kDa) ở đầu N, protein dung hợp vẫn thể hiê ̣n hoa ̣t tính kháng khuẩn [84].

Để biểu hiện đƣợc trong nấm men, gen entP cần đƣợc tách dòng lần thứ 2 để đƣa vào hai đầu gen các trình tự nhận biết của enzyme cắt hạn chế, qua đó có thể dễ dàng đƣa gen vào vùng đa nối và phù hợp với khung đọc trên các vector biểu hiện. Vì trình tự vùng đa nối và các trình tự tín hiệu trên vector pPIC9 và pPICZA hoàn toàn tƣơng tự nhau nên trình tự gen entP và hisentP theo thiết kế nhƣ trên hoàn toàn phù hợp để có thể đƣa vào cả 2 vector. Sơ đồ thí nghiệm tách dòng gen entP và

76

Hình 3.13. Sơ đồ tách dòng gen entP, hisentP vào vector pJET1

3.3.1.1. Khuếch đại gen entP sử dụng cặp mồi đặc hiệu

Với mục đích đƣa vào vector pPIC9 và pPICZA để biểu hiện trong nấm men P. pastoris, cặp mồi đặc hiệu thứ nhất (ký hiệu entP-pastoris F3/XhoI và entP- pastoris R3/NotI, Bảng 2.1) dùng cho khuếch đại gen entP đã đƣợc thiết kế thêm vị trí cắt của enzyme hạn chế XhoI - NotI ở hai đầu gen entP. Đồng thời, để duy trì cấu trúc hoàn toàn tự nhiên (native) của protein EntP sau khi phiên mã, trình tự oligonucleotide mã hóa cho tín hiệu cắt protein dung hợp trên vector (Kex 2 signal cleavage) đƣợc thêm vào sau vị trí cắt của XhoI, ngay trƣớc gen entP. Cặp mồi đặc hiệu thứ 2 (ký hiệu F4/EcoRI và entP-pastoris, Bảng 2.1) đƣợc thiết kế thêm trình tự mã hóa cho (His)6-Asp-Pro ở đầu 5’ và trí cắt của enzyme hạn chế EcoRI - NotI ở hai đầu gen hisentP. Theo tính toán, thực hiện phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi này với khuôn mẫu là sản phẩm của phản ứng Klenow (phần 3.1) sẽ thu đƣợc hai đoạn gen là entP và hisentP có kích thƣớc tƣơng ứng là 158 bp và 173 bp. Hai đầu đoạn gen entP mang trình tự nhận biết của cặp enzyme hạn chế XhoI - NotI. Hai đầu

EcoRI + NotI

hisentP

XhoI + NotI

Gen entP - sản phẩm của phản ứng Klenow

PCR

Gen entP - sản phẩm của phản ứng Klenow

PCR

entP

77

đoạn gen hisentP mang trình tự nhận biết của cặp enzyme hạn chế EcoRI - NotI. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7% (Hình 3.14) cho thấy phản ứng PCR với hai cặp mồi đặc hiệu đã tạo đƣợc hai băng DNA sáng, sắc nét, có kích thƣớc > 100 bp, tƣơng đƣơng với kích thƣớc theo tính toán của gen entP, hisentP đủ tiêu chuẩn làm vật liệu cho tách dòng tiếp theo.

Hình 3.14: Phân tích sản phẩm PCR khuếch đại gen entP và gen hisentP trên gel agarose 1,7%

1: Sản phẩm PCR nhân gen entP; 2: Sản phẩm PCR nhân gen hisentP; 3: Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)

3.3.1.2. Ghép nối gen entP, hisentP vào vector tách dòng pJET1/blunt tạo vector pJETentP, pJEThisentP và biến nạp sản phẩm nối ghép vào tế bào E. coli DH5

Quá trình ghép nối gen entP vào vector tách dòng pJET1 đƣợc thực hiện theo quy trình của bộ sản phẩm pJET1 cloning kit. Trong quá trình nhân gen, enzyme đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR là Taq-DNA polymerase có tính năng gắn thêm một bazơ adenin (A) ở đầu 3’ của mỗi sợi DNA sau khi tổng hợp. Do đó, sản phẩm PCR sẽ thừa ra một bazơ A ở mỗi đầu. Hai bazơ A này đƣợc loại đi bằng enzyme tạo đầu bằng (DNA blunting enzyme) trong pJET1 cloning kit. Sản phẩm của phản ứng cắt này tiếp tục đƣợc ghép nối vào vector pJET1 nhờ enzyme T4 DNA ligase. Tỷ lệ giữa sản phẩm PCR và vector pJET1 trong phản ứng nối ghép gen là 3:1. Sản phẩm plasmid tái tổ hợp thu đƣợc sau phản ứng ghép nối là hai plasmid tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pJETentP và pJEThisentP đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5 theo

hisentP entP bp - 1000 - 500 - 200 - 100 1 2 3

78

phƣơng pháp sốc nhiệt và chọn dòng trên môi trƣờng LBA.

Để chọn đƣợc dòng plasmid mang đúng gen entP, hisentP nhƣ thiết kế, chúng tôi đã nuôi cấy một số dòng tái tổ hợp thu đƣợc, tách plasmid và cắt kiểm tra bằng các enzyme cắt hạn chế kết hợp với giải trình tự để kiểm tra gen.

3.3.1.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJETentP, pJEThisentP bằng các că ̣p enzyme hạn chế

Hình 3.15. A) Sơ đồ cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJETentP/pJEThisentP bằng cặp enzyme XhoI + NotI/EcoRI + NotI tƣơng ứng

B) Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJETentPvà

pJEThisentP bằng cặp enzyme XhoI + NotI và EcoRI + NotI trên gel agarose 1,7%

1: Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas); 2: Sản phẩm cắt plasmid pJETentP; 3: Sản phẩm cắt plasmid pJEThisentP

Hai loại plasmid tái tổ hợp pJETentP và pJEThisentP đƣợc cắt kiểm tra bằng 500 – 1 2 3 300 – 200 – 100 – bp 1000 – ~320 bp ~300 bp hisentP entP ~2800 bp XhoI/EcoRI Not I pJET1-entP 3260 bps eco47IR entP PlacUV5 rep (pMB1) bla NotI (154) EcoRI (178)

gen entP/hisentP (158/173 bp) một phần vector (~ 300 bp) phần còn lại của vector

(~ 2800 bp)

XhoI + NotI hoặc

EcoRI + NotI pJETentP/

pJEThisentP ~ 3300 bps

79

cặp enzyme hạn chế ở hai đầu đoạn gen đã thiết kế từ trƣớc: cặp enzyme XhoI -

NotI với plasmid pJETentP và cặp enzyme EcoRI - NotI với plasmid pJEThisentP. Dựa vào bản đồ các điểm cắt giới hạn có thể thấy trên vector pJET1 cũng có các trình tự nhận biết điểm cắt của XhoI (vị trí 478), NotI (154) và EcoRI (178). Gen entP và hisentP đƣợc đƣa vào vùng đa nối ở vị trí giữa XhoI và XbaI. Ở cả hai loại plasmid, dù gen đƣợc đƣa vào theo chiều nào, khi cắt đồng thời với cặp enzyme

XhoI-NotI hay EcoRI-NotI tƣơng ứng, đều tạo ra 3 đoạn DNA có thể nhìn thấy trên bản gel điện di. Đoạn thứ nhất có kích thƣớc bằng đúng gen entP hay hisentP (158 hoặc 173 bp), đoạn thứ hai có kích thƣớc ~320 bp (với plasmid pJETentP) và ~300 bp (với plasmid pJEThisentP) là kích thƣớc đoạn DNA trên vector bị cắt tại vị NotI (154) hoặc EcoRI (178) của vector đến vị trí NotI hoặc EcoRI của gen entP/hisentP

trong vùng đa nối (478) và đoạn thứ ba có kích thƣớc khoảng 2800 bp là phần còn lại của vector (Hình 3.15A).

Trong số 12 dòng plasmid pJETentP đƣợc cắt kiểm tra với cặp enzyme XhoI – NotI có 8 dòng tạo đƣợc sản phẩm cắt nhƣ tính toán. Đối với plasmid pJEThisentP trong số 12 dòng đƣợc cắt kiểm tra với EcoRI và NotI có 10 dòng tạo đƣợc sản phẩm cắt nhƣ mong đợi. Trong số đó, một dòng plasmid pJETentP và một dòng pJEThisentP (Hình 3.15B) đƣợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.1.4. Kiểm tra gen entP trong vector tách dòng bằng giải trình tự gen

Để chắc chắn gen entP, hisentP đã đƣợc tách dòng có trình tự đúng, không bị đột biến chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen của các dòng plasmid tái tổ hợp pJETentP và pJEThisentP. Kết quả giải trình tự cho thấy, gen entP và hisentP trong vector tách dòng đều có chứa 135 nucleotide mã hóa cho protein EntP, tƣơng đồng 98% với trình tự gen entP trên ngân hàng gen mã số AF005726.1 (Hình 1, Hình 2 phụ lục). Hai nucleotide sai khác là kết quả của việc thiết kế mồi có chủ định nhằm cải biến mã nhằm tránh bộ ba hiếm trong nấm men. Mặc dù vậy, sau quá trình dịch mã, trình tự amino acid của protein EntP tái tổ hợp vẫn hoàn toàn trùng khớp với trình tự amino acid của EntP tự nhiên. Bên cạnh đó, các trình tự oligonucleotide mã hóa cho tín hiệu cắt protein dung hợp trên vector và trình tự oligonucleotide mã hóa

80

cho 6His-Asp-Pro trong gen hisentP hoàn toàn trùng khớp nhƣ đã thiết kế.

Nhƣ vậy, gen entP và hisentP đã đƣợc tách dòng thành công trong vector pJET1. Trình tự của plasmid tái tổ hợp trùng khớp với thiết kế ban đầu của thí nghiệm.

3.3.2. BIỂU HIỆN GEN entP, hisentP TRONG NẤM MEN P. patoris GS115

Hình 3.16. Sơ đồ quá trình biểu hiện gen entP, hisentP trong nấm men P. pastoris GS115

EcoRI + NotI

XhoI + NotI

8kp

Biểu hiện gen trong nấm men P. pastorisGS115

SalI

Biểu hiện gen trong nấm men P. pastorisGS115

81

3.3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICentP, pPIChisentP

Thu gen entP, hisentP từ cá c plasmid tái tổ hợp pJETentP, pJEThisentP

Chúng tôi đã tiến hành cắt song song vector pJETentP và vector pPIC9 bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và NotI, cắt vector pJEThisentP và vector pPIC9 bằng cặp enzyme EcoRI và NotI nhằm bộc lộ các đầu dính bổ sung đã thiết kế. Sau khi các enzyme cắt hoàn toàn, tiến hành thu, tinh sạch đoạn gen entP, hisentP và vector pPIC9 đã mở vòng qua cột Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.17) và sử dụng cho phản ứng nối ghép gen tiếp theo.

Hình 3.17. Điện di kiểm tra các đoạn gen sau khi tinh chế qua cột Qiagen

1, 2: Gen entP và hisentP; 3: Plasmid pPIC9; 4: Plasmid pPIC9 đƣợc cắt bởi XhoI-NotI; 5: Plasmid pPIC9 đƣợc cắt bởi EcoRI-NotI; 6: Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas)

Kết quả thể hiện trên điện di đồ cho thấy ở đƣờng chạy số 1 và 2 xuất hiện hai băng có kích thƣớc tƣơng ứng với gen entP và hisentP, chứng tỏ hai gen này đã đƣợc thu lại thành công sau khi tinh sạch qua cột Qiagen. Bên cạnh đó, đƣờng chạy plasmid pPIC9 nguyên vẹn cao hơn hẳn và bao gồm 2 băng, so với đƣờng chạy điện di hai plasmid đã đƣợc xử lý mở vòng bằng enzyme hạn chế là một băng duy nhất, sáng và sắc nét, có kích thƣớc đúng bằng kích thƣớc vector pPIC9, chứng tỏ vector pPIC9 đã đƣợc cắt mở vòng bởi cặp enzyme hạn chế. Nhƣ vậy, các thành phần của vector đã sẵn sàng cho phản ứng nối ghép gen.

1 2 3 4 5 6 bp – 250 – 1.000 – 2.000 – 10.000

82

Ghép nối gen entP , hisentP vào vector pPIC 9 và biến nạp vector biểu hiện pPICentP và pPIChisentP vào tế bào E. coli DH5

Phản ứng nối ghép đƣợc thực hiện nhờ tác dụng của T4-DNA ligase ở 16o

C trong 16 giờ. Tỷ lệ giữa các thành phần trong phản ứng: entP, hisentP/ pPIC9 tƣơng ứng là 3:1. Sản phẩm của phản ứng là 2 vector tái tổ hợp đƣợc ký hiệu là pPICentP, pPIChisentP.

Để chọn plasmid mang đúng gen nhƣ thiết kế trƣớc khi đƣa vào chủng biểu hiện, sản phẩm của phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trƣờng LBA. Nhờ hoạt động của gen kháng Amp có mặt trên plasmid pPIC9, chỉ những thể biến nạp nào có chứa vector tái tổ hợp pPICentP, pPIChisentP hoặc vector pPIC9 tự đóng vòng mới có thể sinh trƣởng và tạo thành khuẩn lạc. Để chọn đƣợc các dòng chứa vector tái tổ hợp pPICentP, pPIChisentP chúng tôi đã nuôi cấy một số chủng tái tổ hợp, tách chiết DNA plasmid và cắt kiểm tra plasmid bằng các enzyme hạn chế.

Hình 3.18. Điện di sản phẩm cắt các vector tái tổ hợp trên gel agarose 1,2%

1-3: pPICentP đƣợc cắt bởi Xho I-Not I; 4-6: pPIChisentP đƣợc cắt bởi EcoRI-NotI; 8: thang DNA chuẩn 50 bp; 9-11: các plasmid pPICentP, pPIChisentP, pPIC9; 12 : thang DNA chuẩn 1kb ; 13-15: vector pPICentP, pPIChisentP, pPIC9 đƣợc cắt bởi SalI.

Theo tính toán, vector pPICentP và pPIChisentP khi đƣợc cắt bởi các cặp enzyme hạn chế tƣơng ứng là XhoI-NotI và EcoRI-NotI sẽ cho ra các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng là 158 bp, 173 bp. Mặt khác, do trên trình tự 5’ AOX1 của

1 2 3 4 5 6 7 8 - 100 - 50 - 200 - 300 - 500 - 1000 bp 9 10 11 12 13 14 15 - 250 - 500 - 750 - 1000 - 10000 - 8000 - 1500 - 2000 bp

83

vector gốc có chứa một vị trí nhận biết của enzyme SalI trong khi trên gen

entP, hisentP không có vị trí này nên với cả 3 loại vector, khi cắt bằng enzyme SalI

đều đƣợc mở vòng. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 3 loại vector với các enzyme hạn chế khác nhau trên hình 3.18 hoàn toàn trùng khớp với tính toán chứng minh rằng gen entP và hisentP đã đƣợc đƣa vào trong vector pPIC9.

Một dòng plasmid pPICentP và plasmid pPIChisentP có sản phẩm cắt đúng nhƣ tính toán đƣợc tinh sạch và giải trình tự để khẳng định khung đọc trên vector biểu hiện. ctcgagaaaagagctactcgttcatatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgt L E K R A T R S Y G N G V Y C N N S K C tgggttaactggggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggct W V N W G E A K E N I A G I V I S G W A tctggtttggcaggtatgggacattaagcggccgc S G L A G M G H - A A ctcgagaaaagagaggctgaagcttacgtagaattccatcatcatcatcatcatgacccg L E K R E A E A Y V E F H H H H H H D P gctactcgttcatatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgttgggttaactgg A T R S Y G N G V Y C N N S K C W V N W ggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggcttctggtttggca G E A K E N I A G I V I S G W A S G L A ggtatgggacattaagcggccgc G M G H - A A

Hình 3.19. Kết quả giải trình tƣ̣ gen và trình tự amino acid tƣơng ƣ́ng của vùng gen ngoại lai trên plasmid tái tổ hợp pPICentP (A) và pPIChisentP (B)

Phần màu xám: trình tự amino acid tƣơng ứng của gen entP. Mũi tên  chỉ vị trí phân cắt protein dung hơ ̣p sau di ̣ch mã, mũi tên  chỉ vị trí phân cắt bởi axit formic.

Kết quả giải trình tự trên hình 3.19 cho thấy: trình tự của 2 plasmid tái tổ hợp trùng khớp với thiết kế ban đầu và phù hợp với khung đọc trên vector biểu hiện. Với plasmid pPICentP, peptide EntP sau di ̣ch mã có trình tự hoàn toàn giống với EntP tƣ̣ nhiên mà không mang theo bất cƣ́ mô ̣t amino acid ngoa ̣i lai nào . Ở plasmid pPIChisentP, protein tái tổ hơ ̣p sau di ̣ch mã chƣ́a mô ̣t đoa ̣n trình tƣ̣ 6 histidine phu ̣c vụ cho mục đích tinh chế nhờ sắc ký ái lƣ̣c. Đoa ̣n amino acid này sẽ bi ̣ cắt dƣới tác dụng của axit formic để giải phóng peptide EntP có trình tự giống với trình tự của

XhoI

EcoRI

A

84

EntP tƣ̣ nhiên và mang thêm 1 amino acid Proline ở đầu N.

Dƣ̣a trên kết quả giải trình tƣ̣ này , plasmid pPICentP và pPIChisentP đƣợc chuẩn bị với lƣợng lớn dùng cho tích hợp vào hệ gen nấm men P. pastoris GS115.

3.3.2.2. Tích hợp vector biểu hiện pPICentP và pPIChisentP vào hệ gen của nấm men P. pastoris GS115

Để định hƣớng vector tích hợp hiệu quả vào gen his4 đã bị đột biến trong hệ gen của nấm men P. pastoris GS115, khoảng 10 g vector biểu hiện pPICentP,