Trong thiết kế thí nghiệm, vector pJET1 chỉ đƣợc sử dụng cho mục đích tách dòng. Vì vậy, gen entP cần đƣợc chuyển từ vector này sang vector biểu hiện pTWIN1 là vector có nhiều ƣu điểm thuận lợi cho việc biểu hiện gen ngoại lai do có mang promoter mạnh. Mặt khác, do EntP là một protein có kích thƣớc rất nhỏ (khoảng 4,6 AF005726.1 entP AF005726.1 entP AF005726.1 entP
66
kDa) nên việc biểu hiện độc lập trong tế bào E. coli thƣờng gặp nhiều khó khăn do rất khó nhận biết khi bị các protease của vật chủ phân cắt. Mặt khác, tuy EntP không tác dụng trên vi khuẩn đích là E.coli từ môi trƣờng ngoại bào nhƣng cũng không loại trừ khả năng tế bào chủ bị ảnh hƣởng khi có mặt bacteriocin này đƣợc sinh ra từ nội bào. Để tránh hiện tƣợng này, một giải pháp đƣợc đƣa ra là biểu hiện những peptide ngắn, có khả năng gây độc tế bào chủ ở dạng dung hợp với một protein khác mà từ đó ngƣời ta có thể dễ dàng thu hồi lại protein đích thông qua phản ứng phân cắt đƣợc xúc tác bởi enzyme hoặc các tác nhân vật lý, hóa học. Theo đó, hệ vector pTWIN đƣợc thiết kế phù hợp cho việc biểu hiện protein ngoại lai ở dạng dung hợp với các intein. Trong nghiên cứu này, sau khi đƣợc nối ghép vào vector pTWIN1, đoạn gen entP mã hóa cho protein trƣởng thành của EntP sẽ đƣợc biểu hiện ở dạng dung hợp với Mxe GyrA intein (intein2) có gắn CBD (Chitin binding domain) là cấu trúc có khả năng liên kết với chitin. Phản ứng cắt EntP khỏi protein dung hợp đƣợc thực hiện đơn giản nhờ hoạt tính tự phân cắt của intein2 khi có mặt DTT.
3.2.2.1. Thu gen entP từ plasmid tái tổ hợp pJET1-entP
Nhƣ trong phần phân lập gen đã đề cập, khi thiết kế mồi trình tự nhận biết của hai enzyme cắt hạn chế NdeI và SapI đã đƣợc đƣa vào hai đầu đoạn gen entP. Do đó, vấn đề trở nên đơn giản khi sử dụng chính hai enzyme này để thu đoạn gen entP từ vector tách dòng. Đồng thời, để tiến hành nối ghép gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1 thì bản thân vector cũng phải đƣợc cắt mở vòng bằng chính hai enzyme trên để tạo đầu dính bổ sung. Vì vậy, vector pJET1-entP và vector pTWIN1 đƣơ ̣c tiến hành cắt song song bằng cùng một cặp enzyme cắt hạn chế NdeI và SapI. Sau khi các enzyme cắt hoàn toàn, đoạn gen entP và vector đƣợc tinh sạch và thu lại bằng cách cho qua cột Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%.
Kết quả trên điện di đồ (Hình 3.7) cho thấy ở đƣờng chạy số 4 xuất hiện một băng có kích thƣớc trong khoảng 100 đến 200 bp, tƣơng ứng với chiều dài của gen
67
Mặt khác, băng điện di trên đƣờng chạy của plasmid pTWIN1 nguyên vẹn cao hơn hẳn so với băng trên đƣờng chạy điện di của plasmid đã đƣợc xử lý bằng enzyme hạn chế, điều đó chứng tỏ vector pTWIN1 đã đƣợc cắt mở vòng bởi cặp enzyme hạn chế, sẵn sàng cho phản ứng nối ghép gen.
Hình 3.7. Điện di kiểm tra các đoạn gen đƣợc tinh chế bằng cột Qiagen.
1, 5: Thang DNA chuẩn 1 kb và 100 bp (Fermentas); 2: Plasmid pTWIN1 đƣợc cắt bởi
NdeI và SapI; 3: Plasmid pTWIN1; 4: gen entP
3.2.2.2. Nối ghép gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1 và biến nạp vào chủng biểu hiện E. coli ER2566
Sau khi cắt pTWIN1 bằng hai enzym NdeI và SapI, thu và tinh sạch đoạn gen
entP có kích thƣớc 135 bp, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nối ghép nhờ T4-DNA ligase. Vector tái tổ hợp thu đƣợc có tên là pTWIN1-entP. Sản phẩm nối ghép này đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli ER2566 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Để có dòng đối chứng, chúng tôi đã biến nạp vector pTWIN1 nguyên vẹn ban đầu vào chủng E. coli ER2566. Các sản phẩm biến nạp đƣợc chọn lọc dựa trên cơ chế kháng kháng sinh. Chỉ những tế bào E. coli nào đã tích hợp vector pTWIN1-entP
hoặc pTWIN1 nguyên vẹn mới có thể sống đƣợc trên môi trƣờng có Amp nhờ hoạt động của gen kháng kháng sinh bla trên vector.
3.2.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen entP trong vector tái tổ hợp pTWIN1-entP
Trong quá trình nối ghép gen vẫn có trƣờng hợp vector pTWIN1 tự đóng vòng
bp 2
1 3 4 5
pTWIN1/Nde I + Sap I
1000 500 200 100 entP 0,5 1 2 10 kb 6 pTWIN1
68
mà không chứa đoạn gen entP. Vì vậy, để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng, nuôi cấy thu tế bào, tách plasmid và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme hạn chế PstI và
NdeI.
Hình 3.8. A) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTWIN1-entP bằng cặp enzyme
PstI và NdeI
B) Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme
PstI và NdeI trên gel agarose 1,7%
1, 2, 3: Các dòng pTWIN1-entP cắt bằng PstI và NdeI; 4: thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas).
Theo tính toán lý thuyết, khi xử lý vector pTWIN1-entP bằng cặp enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 923 bp (gen entP và Intein2-CBD) và ~ 5,9 kb (phần còn lại của vector) (Hình 3.8A). Kết quả điện di phân tích sản phẩm cắt (Hình 3.8B) cho thấy, tại các đƣờng chạy số 1, 2 và 3 xuất hiện các băng có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán.
Để khẳng định về sự nối ghép thành công đoạn gen entP vào vector biểu hiện pTWIN1, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen. Kết quả cho thấy gen entP đã đƣợc
PstI pTWIN1-entP 6792 bps bla M13 ori ori rop lac I entP Mxe Intein CBD SapI NdeI PstI + NdeI
Phần còn lại của vector (~5,9 kb)
gen entP + Intein2-CBD (923 bp) 10 6 2 1 0,75 0,25 kb 1 2 3 4 ~5,9 kb 923 bp A) B)
69
cài vào vị trí giữa NdeI (5722) và SapI (6437) trên vector pTWIN1. Khung đọc mở (open reading frame – ORF) đƣợc thiết kế sẵn trên vector ở vi ̣ trí 5725 – 7227, đã bao gồm các bô ̣ ba khởi đầu và kết thúc. Nhƣ vâ ̣y, sau khi di ̣ch mã, peptide EntP sẽ đƣợc biểu hiê ̣n dƣới da ̣ng protein dung hợp EntP - MxeIntein - CBD. Sau khi liên kết EntP - MxeIntein đƣợc phân cắt bằng DTT , EntP đƣơ ̣c giải phóng có trình tƣ̣ hoàn toàn giống với EntP tƣ̣ nhiên mà không mang theo bất cƣ́ m ột amino acid ngoại lai nào (Hình 3.9). atacatatggctactcgttcttatggtaatggtgtttattgtaataatagtaaatgttgg M A T R S Y G N G V Y C N N S K C W gttaactggggagaagctaaagagaatattgcaggaatcgttattagtggctgggcttct V N W G E A K E N I A G I V I S G W A S ggtttggcaggtatgggacattgcatcacgggagatgcactagttgccctacccgagggc G L A G M G H C I T G D A L V A L P E G gagtcggtacgcatcgccgacatcgtgccgggtgcgcggcccaacagtgacaacgccatc E S V R I A D I V P G A R P N S D N A I gacctgaaagtccttgaccggcatggcaatcccgtgctcgccgaccggctgttccactcc D L K V L D R H G N P V L A D R L F H S ggcgagcatccggtgtacacggtgcgtacggtcgaaggtctgcgtgtgacgggcaccgcg G E H P V Y T V R T V E G L R V T G T A aaccacccgttgttgtgtttggtcgacgtcgccggggtgccgaccctgctgtggaagctg N H P L L C L V D V A G V P T L L W K L atcgacgaaatcaagccgggcgattacgcggtgattcaacgcagcgcattcagcgtcgac I D E I K P G D Y A V I Q R S A F S V D tgtgcaggttttgcccgcggaaaacccgaatttgcgcccacaacctacacagtcggcgtc C A G F A R G K P E F A P T T Y T V G V cctggactggtgcgtttcttggaagcacaccaccgagacccggacgcccaagctatcgcc P G L V R F L E A H H R D P D A Q A I A gacgagctgaccgacgggcggttctactacgcgaaagtcgccagtgtcaccgacgccggc D E L T D G R F Y Y A K V A S V T D A G gtgcagccggtgtatagccttcgtgtcgacacggcagaccacgcgtttatcacgaacggg V Q P V Y S L R V D T A D H A F I T N G ttcgtcagccacgctactggcctcaccggtctgaactcaggcctcacgacaaatcctggt F V S H A T G L T G L N S G L T T N P G gtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattggtcacatataacggc V S A W Q V N T A Y T A G Q L V T Y N G aagacgtataaatgtttgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgtt K T Y K C L Q P H T S L A G W E P S N V cctgccttgtggcagcttcaatgactgcaggaaggggatccggctgctaacaaagcccga P A L W Q L Q - L Q E G D P A A N K A R aaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcc K E A E L A A A T A E Q - L A - P L G A
Hình 3.9. Kết quả giải trình tƣ̣ gen và trình tự amino acid tƣơng ƣ́ng của plasmid tái
tổ hợp pTWIN1-entP
Phần màu xám: trình tự amino acid tƣơng ứng của gen entP. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt protein dung hơ ̣p bởi DTT.
Nhƣ vâ ̣y , gen entP đã đƣơ ̣c đƣa vào plasmid đ úng khung đọc và phù hợp
70
100% với thiết kế thí nghiệm. Căn cứ vào kết quả này, các dòng plasmid tái tổ hợp đã kiểm tra đƣợc sử dụng để nghiên cứu khả năng biểu hiện gen entP trong tế bào E. coli
ER2566.